ברירה אימונומגנטית שלילית: שיטה לטיהור תאי B מתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

תקציר

מקור: Serra S. et al. בדיקה מבוססת HPLC לניטור מטבוליזם נוקלאוטיד חוץ-תאי / נוקלאוזיד בתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית אנושית. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון מסביר דרך לטהר תאי B על ידי מיקוד אימונומגנטי והפרדה מהשעיית תאי דם חד-גרעיניים היקפיים. השיטה כוללת סימון סוגי תאים לא רצויים עם נוגדנים או ליגנדים ספציפיים (הקשורים לחלקיקים מגנטיים) המכוונים לחלבונים ספציפיים על פני התא, כדי להתרוקן מתרחיף התא ההטרוגני על ידי הפרדה מגנטית.

פרוטוקול

1. טיהור תאי B לוקמיים על ידי בידוד שלילי

1. השהיה מחדש 10⁷ PBMCs/ml ב-PBS אלבומין בסרום בקר 0.1% (BSA) 2 mM EDTA, pH 7.4 (מאגר בידוד).
2. הוסף 10 מיקרוגרם של נוגדנים ראשוניים חד-שבטיים נגד CD3, -CD14 ו-CD16 עבור 10⁷ תאים ודגור במשך 30 דקות ב -4 מעלות צלזיוס.
3. שטפו את התאים עם מאגר הבידוד והצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C.
4. השהה מחדש את התאים במאגר הבידוד ב 10⁷ PBMCs / ml.
5. לפני הדגירה עם התאים, להשעות כבשים נגד עכבר חרוזים מגנטיים IgG בבקבוקון. להעביר 100 μl של חרוזים לכל 10⁷ תאים לצינור.
6. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ בידוד ומניחים את הצינור במחזיק מגנט למשך דקה. משליכים את הסופרנאטנט עם פיפטה של 5 מ"ל.
7. הסר את הצינור מהמגנט והשהה מחדש את החרוזים שנשטפו ב -100 מיקרוליטר של מאגר בידוד.
8. לדגור 10⁷ תאים עם 100 μl של חרוזים מגנטיים במשך 30 דקות ב 4 ° C עם הטיה וסיבוב עדינים.
9. מניחים את הצינור במחזיק המגנט למשך 2 דקות ומעבירים את הסופרנאטנט עם התאים הלא קשורים CD19⁺/CD5⁺ לצינור טרי עם פיפטה של 5 מ"ל.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דם אנושי
אנטי-CD3 מטוהר, -CD14, -CD16	מיוצר בתוך הבית		עכבר חד-שבטי
Dynabeads כבשים נגד עכבר IgG	Invitrogen	11031
מלח חוצץ פוספט (PBS)	אמרסקו	E404-200TABS	טבליות
אלבומין בסרום בקר (BSA)	ביוגרפיה מזהה	1000-70	ציון סטנדרטי
מאגר בידוד			PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA, pH 7.4
מגנט DynaMag-15	Invitrogen	12301ד	מפריד חרוזים מגנטי Dynal