מטבוליזם פורין חוץ-תאי: בדיקה מבוססת HPLC למדידת ייצור אדנוזין ומטבוליזם בתאים לוקמיים

תקציר

מקור: Serra S et al. בדיקה מבוססת HPLC לניטור מטבוליזם נוקלאוטיד חוץ-תאי / נוקלאוזיד בתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית אנושית. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מסביר שיטת כרומטוגרפיה נוזלית כמותית הפוכה בעלת ביצועים גבוהים (RP-HPLC) למדידת חילוף החומרים של אדנוזין ופורינים הקשורים הנוצרים על ידי צריכת AMP בסביבה חוץ-תאית של תאי סרטן לוקמיים. הפרוטוקול מתאר בדיקת RP-HPLC רגישה, ספציפית, אמינה וניתנת לשחזור, שפותחה ואומתה לכימות נוקלאוטידים ונוקלאוזידים פורין חוץ-תאיים המיוצרים על ידי תאי לוקמיה לימפוציטית כרונית מטוהרים (CLL) בתנאי תרבית שונים.

פרוטוקול

1. הכנת פתרונות מלאי סטנדרטיים ומעכבים

1. כדי להכין AMP, לשקול 0.00345 גרם של AMP ולהמיס אותו 5 מ"ל של מדיום ללא סרום כדי לקבל פתרון סטנדרטי 2 mM של AMP.
2. כדי להכין ADO, לשקול 0.00265 גרם של ADO ולהמיס אותו 5 מ"ל של מדיום ללא סרום כדי לקבל פתרון סטנדרטי 2 mM של ADO.
3. כדי להכין INO, לשקול 0.00268 גרם של INO ולהמיס אותו 5 מ"ל של מדיום ללא סרום יש פתרון סטנדרטי 2 mM של INO.
4. הכינו תמיסה של 400 מיקרומטר של AMP, ADO ו-INO על ידי ערבוב 1 מ"ל של תמיסת ציר 2 מילימטר ב-4 מ"ל של מדיום ללא סרום (5 מ"ל נפח סופי).
   1. בצע דילול של 1:4 מכל תמיסה סטנדרטית של 400 מיקרומטר כדי לקבל ריכוז של 100 מיקרומטר על ידי פיפטציה של 500 מיקרוליטר של תמיסת 400 מיקרומטר ב-1,500 מיקרוליטר של תווך ללא סרום (נפח סופי של 2 מ"ל).
   2. הכינו דילולים סדרתיים של כל תרכובת בתווך נטול סרום כדי להשיג את הריכוזים הבאים: 100 מיקרומטר - 50 מיקרומטר - 25 מיקרומטר - 10 מיקרומטר - 5 מיקרומטר - 2.5 מיקרומטר - 1 מיקרומטר - 0.5 מיקרומטר - 0.25 <מיקרומטר /> הערה: לדוגמה, פיפטה 1 מ"ל של תמיסת 100 מיקרומטר ב 1 מ"ל של מדיום ללא סרום (דילול 1: 2) כדי לקבל ריכוז של 50 מיקרומטר ולהמשיך עם שאר הדילולים.
5. הכן פתרון מלאי של 10 mM של APCP מומס ב- PBS; aliquot ומלאי ב - 30 °C.
6. הכן 10 mM תמיסות מלאי של EHNA hydrochloride, dCF ו dipyridamole מומס dimethyl sulfoxide (DMSO); aliquot ומלאי ב -30 °C.

2. תכנת את שיטת HPLC

1. הכינו חיץ אמוניום אצטט של 7 מילימטר על ידי המסת 0.770 גרם של אמוניום אצטט ב-2 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה כפולה (Buffer A). יש להתאים ל-pH 3.0 עם חומצה הידרוכלורית.
2. הכינו בקבוק זכוכית המכיל לפחות 2 ליטר של אצטוניטריל טהור במיוחד עבור HPLC (Buffer B) וחברו את עמוד השמירה ואת העמוד ל-HPLC.
   הערה: העמודות והמאגרים נמצאים ב- RT בזמן השימוש.
3. היכנס לתוכנת HPLC ובחר בלחצן "עיון בפרויקט". עבור לתפריט "קובץ" ובחר "שיטה חדשה" ולאחר מכן "שיטת מכשיר".
4. תכנת את שיטת עמודת שיווי המשקל לפי טבלה 1. הגדר קצב זרימה של 1.00 מ"ל/דקה ותכנת את גלאי ה- UV כך שיקרא ב- 260 ננומטר. שמור את שיטת המכשיר ובחר שוב "שיטה חדשה" מתפריט "קובץ" ולאחר מכן "ערכת שיטות". בחרו בשיטת המכשיר שנשמרה בעבר ושמרו את ערכת השיטות הנוכחית באותו שם.
5. חזור על שלב 2.3 כדי לתכנת את שיטת ההפעלה לדוגמה המצוינת בטבלה 2. הגדר קצב זרימה של 1.00 מ"ל לדקה ותכנת את גלאי UV לקרוא ב 260 ננומטר. שמור את שיטת ההתקן וחזור על אותו הליך המתואר בשלב 4.4 כדי לשמור את ערכת השיטות.
6. בחר את הלחצן "הפעל דוגמאות", בחר "שיטת ערכת דוגמאות חדשה" מתפריט "קובץ".
7. בחר באפשרות "ריק" והזן את מספר הבקבוקון (בדוגם האוטומטי), את שם הדגימה, את נפח ההזרקה (50 מיקרוליטר). בחר את ערכת השיטות שנשמרה בעבר עבור העמודה "ערכת שיטות" והזן את זמן הפעולה הכולל (min).
   הערה: הזן את שיטת עמודת שיווי המשקל (טבלה 1) בעמודה "ערכת מתודות" לפני כל הפעלה לדוגמה והזן את זמן הפעולה הכולל (מינימום).

3. יצירת עקומת כיול סטנדרטית לכל תרכובת

1. יש להזריק 50 μl של ריק (תווך ספציפי ללא סרום, שאינו מכיל אדנוזין דמינאז) ושל כל דגימה סטנדרטית בהתאם לשיטות המתוארות בטבלה 1 ובטבלה 2.
   1. השתמש בשיטת עמודת שיווי משקל (טבלה 1) לפני כל הפעלת דגימה והגדר את תנאי מעבר הצבע המתוארים בטבלה 2 כדי לקבל הפרדת שיא מספקת. עיין בטבלה 3 לקבלת זמני השמירה המדווחים של AMP, ADO ו-INO בתנאי HPLC אלה.
   2. קבע את אזור השיא של AMP, ADO ו- INO בריכוזים שונים תוך בחירת כפתור "תהליך" בתוכנת HPLC ולאחר מכן באפשרות "שילוב". לחלופין, בחר ידנית את נקודות ההתחלה והסיום של כל פסגה.
   3. התווה את אזורי השיא כנגד הריכוז הנומינלי של כל תקן כדי לקבל את עקומת הכיול בת תשע הנקודות (100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25 מיקרומטר).
   4. חישוב המשוואה של קו ישר עבור AMP, ADO ו- INO: y = mx + b,
      כאשר x הוא ריכוז μM ו- y מתאימים לאזור הפסגה.

   זמן	קצב זרימה (מ"ל/דקה)	%A	%ב
   	1.00	100	0
   1.24	1.00	100	0
   6.22	1.00	2	98
   18.65	1.00	2	98

   טבלה 1: שיטת עמודת שיווי משקל. ייצוג סכמטי של שינויי ממס עבור שיווי המשקל של העמודה. חיץ A: 7 mM אמוניום אצטט, pH 3.0. חיץ B: אצטוניטריל.

   זמן	קצב זרימה (מ"ל/דקה)	%A	%ב
   	1.00	0	100
   3.74	1.00	0	100
   13.71	1.00	15	85
   17.00	1.00	100	0
   20.00	1.00	100	0

   טבלה 2: הפעלת פעולת שירות לדוגמה. ייצוג סכמטי של שינויים בממס למדידת HPLC של תרכובות פורין. חיץ A: 7 mM אמוניום אצטט, pH 3.0. חיץ B: אצטוניטריל.

   	זמן שמירה	λמקסימום
   המגבר	8.00 דקות	260
   INO	11.00 דקות	260
   ADO	11.90 דק'	260

   טבלה 3: זמני שמירה של תרכובות פורין. זמני שמירה אופייניים שנצפו עבור AMP, ADO ו- INO. גלאי UV מתוכנת לקרוא ב 260 ננומטר.

   4. טיפול מקדים במעכבים ודגירה עם המצע (AMP)

   1. כדי לבדוק את צריכת AMP, ייצור ADO ו- INO ללא עיכוב של CD73, ADA ומובילי נוקלאוזידים, השהה מחדש את תאי CLL מטוהרים 2 x 10⁶ CD19⁺/CD5⁺ ב- 250 μl של תאי מדיום וצלחת ללא סרום בצלחת 48 באר (או בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל).
   2. הוסף 250 μl של 400 μM AMP או AMP בתוספת מעכבי כדי לקבל ריכוז סופי של 200 μM AMP. כלול תנאי בהיעדר המצע שישמש כדגימה ריקה.
   3. לדגור מ 30 עד 60 דקות ב 37 ° C.
   4. בסוף זמן הדגירה, לאסוף 500 μl של supernatants בצינורות מיקרוצנטריפוגות קר (על קרח) ומיד צנטריפוגה ב 17,000 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
   5. העבירו את הסופרנאטנטים בצינורות מיקרוצנטריפוגות חדשים של 1.5 מ"ל ואחסנו מיד בטמפרטורה של -80°C או המשיכו להכין דגימות לריצות HPLC.

   5. הכנת דוגמאות ל- HPLC

   1. סננו את הסופרנאטנטים בצינורות מיקרוצנטריפוגות חדשים בנפח 1.5 מ"ל באמצעות מסנני מזרקים בגודל 0.2 מיקרומטר. השתמש מזרקים 1 מ"ל לסינון.
   2. אם מערכת HPLC מסופקת עם דוגם אוטומטי, להכין את בקבוקוני זכוכית עבור HPLC ולהשתמש 0.1 מ"ל micro-inserts עבור כמויות קטנות של דגימה.
   3. להעביר לפחות 100 μl של דגימה בבקבוקון זכוכית עם micropipette או פיפטה פסטר זכוכית. יש להקפיד להעביר ללא בועות ולסגור את הבקבוקון עם מכסה הבורג.
   4. הדגימות מוכנות כעת לניתוח על ידי RP-HPLC.

   6. מדידות HPLC של פורינים

   1. בחר בכפתור "הפעל דוגמאות"; בחר "שיטת ערכת דוגמאות חדשה" מתפריט "קובץ".
   2. בחר באפשרות "ריק" וציין: מספר הבקבוקון (בדוגם האוטומטי), שם הדגימה, נפח ההזרקה (50 מיקרוליטר).
   3. בחר בשיטת עמודת שיווי המשקל ובשיטת ההפעלה לדוגמה המתוארות בטבלה 1 ובטבלה 2, בהתאמה, עבור כל הריצות הריקות והדוגמאות הבאות.
      הערה: הגדר את שיטת עמודת שיווי המשקל (טבלה 1) לפני כל הפעלת דגימה.
   4. יש להזריק 50 μl של ריק (מדיום ללא סרום) ושל כל דגימה.
   5. לקבוע את ריכוז הפורין בכל דגימה, לכמת את AMP, ADO ו- INO על ידי קבלת אזורי השיא בזמני השמירה המתוארים בטבלה 3.
      1. בחר את כפתור "תהליך" ולאחר מכן את האפשרות "שלב". לחלופין, בחרו ידנית את נקודות ההתחלה והסיום של כל פסגה בודדת כדי לקבל את מדידת השטח. זה נעשה על ידי מעקב אחר קו בין נקודת ההתחלה והסיום של הפסגה.
      2. קבע את ריכוז μM תוך יישום המשוואה המתקבלת עבור העקומה הסטנדרטית: y = mx + b, כאשר x מייצג את ריכוז μM ו- y הוא שטח הפסגה הנמדד מהמדגם הלא ידוע.
         הערה: דוגמה לעקומת תקן כיול ADO מדווחת באיור 1, כאשר: x = (y area - 981.02)/40026
   6. בהתחשב בכך 2 x 10⁶ תאים היו resuspended ב 0.500 מ"ל של בינוני, לחשב את μmoles של AMP, ADO ו INO נצרך ו / או מיוצר על ידי 10⁶ תאי CLL תוך החלת היחס הבא:
      μmoles : 1,000 ml = x μmoles : 0.250 ml
      הערה: μmoles ב 1,000 מ"ל (מספר μmoles ב 1 L) של שווים לריכוז μM ו x הם μmoles של נוקלאוטיד או נוקלאוזיד המיוצרים על ידי 10⁶ תאים. לבסוף, להמיר את μmoles לתוך nmoles נצרך ו / או מיוצר על ידי 10⁶ תאי CLL: nmoles = μmoles x 1,000

תוצאות

איור 1.יצירת עקומת תקן פנימית.עקומת תקן כיול מייצג עבור ADO והמשוואה היחסית המתקבלת. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סרום AIM V ללא מדיום	גיבקו	12055-091	נוזל (ציון מחקר)
אדנוזין 5'-מונוספט (AMP)	סיגמא-אולדריץ'	A1752
אדנוזין (ADO)	סיגמא-אולדריץ'	A9251
אינוזין (INO)	סיגמא-אולדריץ'	I4125
אצטוניטריל (CHROMASOLV Plus)	סיגמא-אולדריץ'	34998	ברמת HPLC
אמוניום אצטט	סיגמא-אולדריץ'	9688	7 מילימול, pH 3.0
בקבוקוני חוט קצרים	VWR	548-0029	1.5 מ"ל/
מיקרו-תוספות	VWR	548-0006	0.1 מ"ל/
מכסי הברגה	VWR	548-0085	9 מ"מ/PP כחול
אטלנטיס dC18 עמוד	ווטרס	186001344	5 מיקרומטר, 4.6 מ"מ x 150 מ"מ
אטלנטיס dC18 עמוד משמר	ווטרס	186001323	5 מיקרומטר, 4.6 מ"מ x 20 מ"מ
מודול הפרדות ווטרס אליאנס 2965	ווטרס		מודול הפרדת HPLC
גלאי מערך פוטודיודות ווטרס 2998 (PDA)	ווטרס		גלאי UV
תוכנת Waters Empower2	ווטרס