בידוד תאי T-ALL עם תווית פלואורסצנטית: שיטה לבידוד תאי T-ALL מדגי זברה בוגרים

תקציר

מקור: Pruitt, M. M., et al. בידוד אוכלוסיית הצד בלוקמיה לימפובלסטית חריפה של תאי T המושרה על ידי Myc בדגי זברה. J. Vis. Exp. (2017).

פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה של בידוד תאי גידול בעלי תווית פלואורסצנטית של לוקמיה לימפובלסטית חריפה של תאי T (T-ALL) מדגי זברה בוגרים וכימות שלהם באמצעות צבע כחול טריפאן.

פרוטוקול

1. אוסף תאי T-ALL בעלי תווית פלואורסצנטית מדגי הגידול הראשוניים

1. הכינו לפחות 20 מ"ל של 10% סרום בקר עוברי מומת בחום במי מלח חוצצים פוספט 0.9x (FBS/PBS).
2. הוסף 1 מ"ל של FBS/PBS לבקבוקון אחד של מלח נתרן הפרין (300 יחידות).
3. דגים נבחרים הנושאים גידולים ביותר מ-50% מהגוף, או דגים המתקשים לאכול או לשחות. הקריבו את הדגים על ידי מנת יתר שלהם עם טריקאין או על ידי טבילה במי קרח. לאשר מוות על ידי חוסר תנועת זימים ודופק.
4. השתמש בסכין גילוח כדי להסיר את ראש הדג.
5. לשטוף את החלל של הדג עם פתרון הפרין כדי להסיר תאי דם אדומים עודפים.
   1. בעזרת פיפטה מזריקים 100 מיקרוליטר של תמיסת הפרין (מוסיפים 1 מ"ל FBS/PBS לבקבוקון אחד של מלח נתרן הפרין) לחלל הגוף של הדג. הסר את כל הנוזל שנשפך החוצה (הוא יכיל תאי דם) ופיפטה אותו לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
   2. השתמשו בקצה פיפטה טרי כדי לשטוף שוב את הגוף. בצעו לפחות שלוש שטיפות, או עד שהנוזל שנשפך החוצה נראה נקי מדם.
   3. יש להשליך את כל הנוזלים מהשטיפות בשלבים אלה, מכיוון שלא ייעשה בהם שימוש בניתוחים נוספים.
6. לאסוף את תאי לוקמיה.
   1. הזריקו 100 מיקרוליטר של FBS/PBS לחלל הגוף של הדג.
   2. הפעילו לחץ עדין על החלק החיצוני של גוף הדג עם קצה פיפטה כדי לסחוט/לדחוף החוצה את תאי הגידול.
      הערה: אם שלב זה מבוצע באמצעות מיקרוסקופ מנתח, תאי הגידול הנשפכים מחלל הגוף יהיו ניכרים.
   3. אספו את הנוזלים והתאים מכל שטיפה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
   4. חזור על שלבים 1.6.1-1.6.3 עד שרוב תאי הגידול נאספים (בדרך כלל 5-10 פעמים). לאסוף את כל תאי הגידול לתוך אותו צינור microcentrifuge 1.5-mL. שמור את התאים בטמפרטורת החדר.
7. מערבבים את תאי הגידול שנאספו מהשלב הקודם על ידי פיפטציה עדינה שלהם כדי לנתק את גושי התאים. סנן את מתלה התא דרך מסנן רשת שינוי של 40 מיקרומטר. שטפו את המסנן 1-2 פעמים עם 100 מיקרוליטר של FBS/PBS. שמור את התאים בטמפרטורת החדר.
8. יש לערבב 2 μL של תרחיף תאים עם 18 μL של טריפאן כחול (0.4%, מדולל 1:10 ומסונן) בצינור חדש. טען 10 μL על המוציטומטר וספור את מספר התאים הפלואורסצנטיים החיים (שאינם כחולים) כדי לחשב את מספר תאי הגידול המבודדים.
   הערה: תאים שאינם שליליים ל-GFP הם ככל הנראה תאי T נורמליים ולא ממאירים ואין לספור אותם. לפחות 2 x 10⁶ תאים נדרשים כדי להכתים את התאים עם Hoechst 33342.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דג זברה סינגני (CG2)			ראו מזג'ירוב ואח', 2006
RAG2:פלסמיד C-MYC			מעבדת לנגנאו
rag2: פלסמיד GFP שנבנה במעבדת דה יונג			מקדם rag2 ממעבדת לנגנאו
פלסמיד pCS2-transposase			מעבדת צ'יין
מיקרוסקופ SteREO Discovery V8	קרל זיס מיקרוסקופיה	495015-0008-000
טריקאין מתאן-סולפונט (MS-222)	Western Chemical, Inc	פישר סיינטיפיק - NC0342409	100 גרם
סרום בקר עוברי (FBS)	HyClone Laboratories, Inc.	פישר סיינטיפיק - SH3007103	500 מ"ל
מלח חוצץ פוספט (PBS)	Gibco מבית Life Technologies	1001-023	pH 7.4 (1x) - 500 מ"ל
הפרין נתרן מלח	סיגמא-אולדריץ'	2106	בקבוקונים של 15 - 300 יחידות
מסנן רשת שינוי בגודל 40 מיקרומטר	פלקון קורנינג ברנד	352340	מקרה של 50
כחול טריפאן	סיגמא מדעי החיים	T8154	20 מ"ל - תמיסה (0.4%)