$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. צביעת תאי T-ALL המסומנים באופן פלואורסצנטי עם Hoechst 33342 כדי לזהות את אוכלוסיית הצד
- לדלל Hoechst 33342 1:10 עם H2O ללא נוקלאז כדי להפוך את ריכוז העבודה 1 מ"ג / מ"ל. אחסנו את הצבע בטמפרטורה של 4°C ובחושך.
- הכן פתרון 100-mM של verapamil על ידי המסת 49.1 מ"ג ב 1 מ"ל של dimethyl sulfoxide (DMSO).
הערה: Verapamil הוא מעכב של טרנספורטרים ABC והוא בקרה חשובה עבור ניסויים באוכלוסיית צד. הוספת verapamil לדגימות תעכב את היכולת של מובילי ABC להפיץ את צבע Hoechst 33342. לכן, אוכלוסיית לוואי אמיתית תיעלם כאשר verapamil מתווסף לדגימה.
- הגדר אמבט מים ל 28 °C (78 °F).
- הכן דגימות ובקרות בחושך על-ידי הוספת תאים ותמיסות לצינורות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS).
- הכן את הדגימות על ידי הוספת 106 תאים, 15 μL של 1 מ"ג / מ"ל Hoechst 33342, ו 2.5 μL של DMSO לצינור FACS. כוונן את עוצמת הקול ל- 1 מ"ל עם FBS/PBS.
- הכן את הפקדים על ידי הוספת 106 תאים, 15 μL של 1 מ"ג / מ"ל Hoechst 33342, ו 2.5 μL של 100 mM verapamil לצינור FACS. כוונן את עוצמת הקול ל- 1 מ"ל עם FBS/PBS.
הערה: מומלץ לפחות 106 תאים לדגימה, אך עדיף להכתים תאים נוספים, במיוחד אם תאי אוכלוסיית הצד ימוינו לניתוח נוסף. אין לחרוג מ-106 תאים/מ"ל, ולשמור על ריכוז Hoechst 33342 על 15 מיקרוגרם/מ"ל. אם 10 x 106 תאים מוכתמים, נפח התגובה הכולל הוא 10 מ"ל.
- יש לדגור באמבט מים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס בחושך למשך 120 דקות.
- לאחר הדגירה, מניחים את התאים מיד על קרח ושומרים אותם בחושך.
- גלול את התאים ב 4 ° C במשך 6 דקות ב 300 x גרם. להסיר את supernatant. יש לשטוף עם 1 מ"ל של FBS/PBS.
- גלול את התאים ב 4 ° C במשך 6 דקות ב 300 x גרם. להסיר את supernatant. השהה מחדש את התאים ב- 1 מ"ל של FBS/PBS.
- שמור על טמפרטורה של 4°C עד למיון תאים.
- 15 דקות לפני מיון התא, יש להוסיף 2 מיקרוליטר של ציר פרופידיום יודיד (PI) (1 מ"ג/מ"ל) לכל 1 מ"ל של FBS/PBS (ריכוז סופי: 2 מיקרוגרם/מ"ל). מערבבים היטב.
2. השתמש ב- FACS כדי למצוא את אוכלוסיית הצד באוכלוסיית תאי T-ALL המסומנת באופן פלואורסצנטי
- נתח את מתלי תאי T-ALL המוכתמים של דגי הזברה על ממיין תאים המצויד בלייזר UV לעירור צבע Hoechst 33342 ולייזר 488 ננומטר לעירור PI ולזיהוי תאי GFP+ T-ALL.