מאמר שיטה

תגובת Chemotactic של מיקרו אורגניזמים ימיים כדי Micro-Scale שכבות מזין

DOI:

10.3791/203

⸱

28 במאי 2007

 ,  , 
1Environmental Microfluidics Group, MIT - Massachusetts Institute of Technology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייצור של ערוצי microfluidic ויישומן ניסויים לחקר התנהגות ליקוט chemotactic של חיידקים ימיים בתוך נוף ים מזין אחידה והתנהגות שחייה של חיידקים בתוך זרם גזירה מתוארים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המידה שבה planktonic חיידקים יכולים לנצל משאב טלאים microscale יהיו השלכות ניכרות trophodynamics האוקיאנית ושטף biogeochemical. עם זאת, כדי לנצל את תיקוני מזין בים, חיידקים שחייה להתגבר על ההשפעות של כוחות פיזיים כולל דיפוזיה מולקולרית גזירה סוערים, אשר יגבילו את הזמינות של טלאים ואת היכולת של חיידקים כדי לאתר אותם. עד לאחרונה, יש מגבלות מתודולוגיות בדיקות מנועה ישירה של התנהגות של חיידקים בתוך בתי גידול בלתי סדיר ומציאותי בקנה מידה קטן בתנאי זרימה. לפיכך, רוב הידע הנוכחי שלנו לגבי התנהגות של חיידקים בים כבר רכש מהתחזיות התיאורטיות לגביו. כדי להשיג מידע חדש על התנהגות שיחור מזון מיקרוביאלי באוקיינוס ​​יישמנו רך טכניקות ייצור ליתוגרפיות לפתח 2 מכשירים microfluidic, אשר השתמשנו כדי ליצור (i) microscale טלאים מזין עם ממדים ומאפיינים diffusive רלוונטי תהליכים האוקיאנית (ii) microscale מערבולות, עם שיעורי גזירה המקביל לאלה צפוי בים. אלה מכשירים microfluidic התירו בדיקה הישירה הראשונה של השחייה חיידקים וההתנהגות chemotactic בתוך נוף ים הטרוגני ודינמי. השימוש בשילוב של epifluorescence והניגודיות מיקרוסקופיה שלב לאפשר בדיקות ישירה של ממדים פיזיים המאפיינים diffusive טלאים מזין, תוך שמירה על התגובה האוכלוסייה ברמה המצרפית, בנוסף להתנהגות שחייה של חיידקים בודדים. ניסויים אלה גילו כי כמה מינים של פיטופלנקטון, חיידקים heterotrophic ו הפרוטיסטים phagotrophic המיומנים באיתור וניצול לשדר טלאים משאב microscale בתוך מסגרות זמן קצר מאוד. הראינו גם כי עד מתונה בשיעורי גזירה, חיידקים ימיים המסוגלים להילחם זרימה לשחות דרך הסביבה שלהם מרצונם. עם זאת, מעבר לרמת סף גזירה גבוהה, חיידקים מיושרים בזרימת גזירה ומסוגלים פחות שחייה ללא הפרעה מן הזרם. מיקרופלואידיקה מייצג גישה חדשנית וזולה לחקר האקולוגיה של חיידקים ימיים, והן בשל התאמתה במדויק יצירת שדות זרימה מציאותי והדרגות המצע על microscale, הוא החלים באופן אידיאלי בדיקות של התנהגות חיידקים על המאזניים הקטן של אינטראקציה. לפיכך, אנו מציעים כי מיקרופלואידיקה מהווה כלי חשוב להשגת הבנה טובה יותר של האקולוגיה של מיקרואורגניזמים בים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנה

1. יצירת מסכה

שימוש בתוכנת תיב"ם, עיצוב הערוץ עבור הדפסה ברזולוציה גבוהה על שקיפות. זה יהיה "מסכה".

בחדר נקי:

2. נקה ואופים רקיק

ראשית, רקיק להשפריץ עם אצטון, אז מהר עם מתנול, ולאחר מכן עם Isopropanol. לבסוף, לייבש את פרוסות סיליקון באמצעות חנקן.

אופים את פרוסות בתנור (130 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות.

3. ציפוי רקיק

מניחים את פרוסות במרכז מכונה ספין הציפוי. יוצקים photoresist (SU-8) מהבקבוק על פרוסות סיליקון. תן את זרימת SU-8 ולהירגע עבור ~ 10 s. הפעל coater הכביסה, כבש את מהירותה עד 0-500 סל"ד מעל 5 s; לשמור על סל"ד 500 עבור s 10, כבש עד מהירות סופית של מעל 10 ולשמור על מהירות סופית 30 s. המהירות הסופית תלויה עובי הציפוי ממוקד SU-8 בשימוש. פרטים ניתן למצוא בכתובת http://www.microchem.com/

4. רכים לאפות

לאחר ציפוי רקיק, לאפות אותו לראשונה בגיל 65 ° C ולאחר מכן ב 95 ° C. זמן האפייה משתנה עם עובי סוג ממוקד של photoresist בשימוש. אז, בואו פרוסות סיליקון בטמפרטורת החדר במשך לפחות 5 דקות.

5. חשיפה

מניחים את המסכה על גבי פרוסות סיליקון ולחשוף את רקיק לאור UV בפעם מומלץ במדריך SU-8.

6. לאחר חשיפה לאפות

אופים את פרוסות סיליקון ב 65 ° C ולאחר מכן 95 ° C בעקבות SU-8 הוראות שימוש.

7. פיתוח רקיק כדי להשיג את "מאסטר" (עובש)

הכינו כוס מלא היזם (PMMA). לטבול את פרוסות לתוך כוס תוך נדנוד בעדינות את הכוס עד שלא נחשפו חלק של photoresist הוא נשטף.

במעבדה שלנו:

8. הכן PDMS ושופכים אותו על פרוסות סיליקון

מערבבים את PDMS עם סוכן ריפוי שלה ביחס 10:01 לתוך כוס. בוחשים ומערבבים homogenously: זה יפיק המון בועות להפוך את התערובת מבט אטום. יוצקים את התערובת על "אמן".

9. דה בועה בחלל ריק קאמרית

כדי להסיר את הבועות, הניח את התערובת אב PDMS כי הוא מכסה אותה לתוך תא ריק עד שכל הבועות נעלמו.

10. אפייה בתנור

אופים במשך לפחות 12 שעות בתנור ב 65 ° C להקשיח את PDMS.

11. פאנץ חורים

קולפים את PDMS מן האדון וחורים אגרוף עבור פתחי הכניסה שקעים של הערוצים.

בכל חדר נקי (לא מוצג)

12. פלזמה מליטה

ערוצי מודבקים לשקופית זכוכית לאחר הטיפול הן את שכבת PDMS ואת שקופיות זכוכית עם פלזמה חמצן דקות 1.

ניסויים:

Exp # 1: לחקור את התגובה chemotactic של חיידקים ימיים כדי מיקרו סולם שכבות תזונה

1) הגדרת הניסוי

  1. הוסף אורגניזמים מצעים כדי מזרקים זכוכית
  2. המקום ערוץ microfluidic לבמה מיקרוסקופ ולצרף צינורות אל פתחי הכניסה שקעים המתאים
  3. חיבור צינורות לבזבז המאגר. ודא צינורות הוא שקוע כולו מאגר פסולת בנוזל, כדי למנוע תנודות בלחץ
  4. מזרקים מקום על משאבת מזרק להתחבר שסתומים צינורות
  5. הגדרת מיקרוסקופ: בתנאי אור, הגדלה וכו '
  6. פוקוס על המיקום המתאים בערוץ
  7. דה בועה הערוץ באמצעות מזרק גדול מלא במי ים מלאכותי
  8. הגדר קצב הזרימה המתאים על משאבת מזרק. במקרה זה 2 מ"ל / דקה, אשר תואמים את מהירות זרימה ממוצעת של 220 s -1 מיקרומטר בערוץ

2) הפעלת הניסוי

  1. הפעל את משאבת מזרק להקים שיפוע מזין בערוץ
  2. לאחר זרימה התייצב ותזמורת של חומרים מזינים פיתחה, לעצור את הזרימה על המשאבה את המזרק ולהתחיל זמן הקלטה מנקודה זו
  3. הלהקה מזין מתחיל מפוזר רוחבית
  4. במרווחי זמן קבועים, שימוש בתוכנות ניתוח תמונה להקליט רצף של מסגרות כדי ליצור "סרטים"
  5. להפלות אורגניזמים שחייה ידי נטילת זמן ההבדל בין שתי מסגרות לתמונות הבאות, כך שרק אובייקטים נעים כעת דמיינו, מה שמאפשר לנו להבדיל בין תאים ניעתי שאינו זז חלקיקים רעשי רקע
  6. קח סרטים לקבוע עמדות של תאים בערוץ תוך התייחסות position התיקון מזין
  7. סרטים שיא במרווחי זמן קבועים במשך 10-20 דקות לנתח את עמדות ודפוסי השחייה של אורגניזמים
  8. באמצעות תוכנת ניתוח התמונה כדי להניח את העמדות של אורגניזמים במסגרות שונות (הקצאת כל פיקסל בעוצמת האור המרבית נרשמה פיקסל שבמהלך תקופת הסרט), אנו יכולים לקבל מידע על מסלול תאים שחייה

Exp # 2: לחקור את ההשפעות של גזירה על חיידקים ימיים שחייה vortexZ

  1. שימוש בגיאומטריה ערוצים שונים, אנחנו יכולים לצפות את ההתנהגות של חיידקים שחייה במערבולת בשיעורים גזירה שונים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנה של האופן שבו חיידקים ימיים אינטראקציה עם כימיקל המקומית שלהם הסביבה הפיזית הכרחי עבור תפיסה מלאה ומדויקת יותר של התפקיד של מיקרואורגניזמים planktonic ב מזין האוקיינוסים ופחמן מחזורים (עזאם ו Malfatti 2007). עם זאת, בשל המאזניים קטן (מ"מ <) על אינטראקציות אשר רבים של חיידקים חשובים מתרחשים, מגבלות טכניות מנעו בדיקות מפורטות של התנהגות של חיידקים בתוך הנוף ביו פיסיקלי כימי הטרוגנית חזו להיות מנוסים על ידי חיידקים שחייה בים. התפתחויות אחרונות מיקרופלואידיקה (Whitesides et al. 2001) אפשרו נית...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות מיקרוסיסטמס מעבדות טכנולוגיה ב-MIT עבור ומאפשר לנו חלק בסרט הווידאו הזה במתקן חדר נקי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PDMS, Sylgard 184ערכה לאלסטומר סיליקוןDow Corninghttp://www.ellsworth.com/sylgard.html
SU8-2100פוטורזיסטMicroChem Corp.www.microchem.com
מיקרוסקופ הפוך Nikon Eclipse TE2000-EמיקרוסקופNikon Instruments
צינור PEEK (קוטר פנימי 0.762 mm, קוטר חיצוני 1.59 mm)כליUpchurch Scientificwww.upchurch.com
מזרקים (קצה Luer-Lok)כליBD Biosciences
מתאם חלק P-704-01כליUpchurch Scientificלחיבור צינור למזרקים בעלי קצה Luer-Lok
משאבת מזרקים (PHD 2000 Programmable)ציודHarvard Apparatus
מצלמת CCD (PCO 1600)ציודCook

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
  2. Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
  3. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
  4. Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).
  5. Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).
  6. Marcos,, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).
  7. Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
  8. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PDMS

מאמרים קשורים