מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

סיכום

אנו מספקים שיטה לשחזור עבור monolayers culturing ומחוברות של העובר תאים אנושיים אפיתל הפיגמנט ברשתית (hfRPE) תאים התערוכה מורפולוגיה, פיזיולוגיה, קוטביות, וחלבון וביטוי גנים דפוסים של רקמת יליד מבוגר. עבודה זו הורחבה במודל חיה של מחלות עיניים שונות.

תקציר

פיתחנו תרבות התא הליך זה יכול לייצר כמויות גדולות של monolayers ומחוברות העיקרי של האדם העובר אפיתל הפיגמנט ברשתית (hfRPE) עם תרבויות, מאפיינים מורפולוגיים פיזיולוגיים הגנטי של הרשתית האדם הילידים. אלה בתרביות תאים hfRPE התערוכה פיגמנטציה כבד, מיקרוסקופית אלקטרונים להראות נרחב microvilli קרום apical. מתחמי junctional זוהו עם תיוג immunofluorescence של חלבונים שונים צומת חזק. הקוטביות פונקציה אפיתל של תרבויות אלה העיקרי לשחזור בקלות דומים למד בעבר מודלים יונקים של הרשתית הילידים, כולל האדם. תוצאות אלו הוארכו על ידי פיתוח של התערבויות טיפוליות במודלים של בעלי חיים שונים של מחלת העין האנושית. התמקדנו אסטרטגיות להסרת הצטברות נוזל נורמלי ברשתית או רווח subretinal. החלל subretinal תאיים המפריד בין מגזרים photoreceptor החיצוני של קרום apical של הרשתית לבין הוא קריטי עבור תחזוקה של קבצים מצורפים הרשתית וכן שורה שלמה של הרשתית / הרשתית אינטראקציות.

פרוטוקול

1. רקמה עוברית האדם

כל מחקר רקמה אנושית הקשורות להלן העקרונות של הצהרת הלסינקי ועל הלוח סקירה מוסדיים NIH. העיניים עוברית מתקבלים על ידי הסרסור עצמאית, משאבי Bioscience מתקדם (ABR, Alameda, CA), מתורמים אקראיים על 16-22 שבועות של הריון, להציב RPMI-1640 מדיה המכילה צינורות (המסופקים על ידי abr), ארז על קרח, נמסר על ידי שירות עדיפות לילה הלידה. רקמות להישאר קיימא עד 48 שעות לאחר enucleation.

2. תרבית תאים בינוני

ממ אלפא שונה בינוני (סיגמא אולדריץ) משמש כמדיום הבסיס להכין 5% ו -15% סרום המכיל מדיה culturing של תאים הרשתית (בינוני הרשתית; טבלה 1 להלן).

שם	סיגמא	Gibco	כמות	אחסון
ממ, אלפא שינוי	M-4526		500 מ"ל	4 ° C
N1 תוספת	N-6530		5 מ"ל	4 ° C
פניצילין, סטרפטומיצין		15140-148	5 מ"ל	-20 ° C
GlutaMax - אני		35050	5 מ"ל	-20 ° C
ללא חומצות האמינו החיוניות	M-7145		5 מ"ל	4 ° C
THT *				-80 ° C
טאורין	T-0625		125 מ"ג
הידרוקורטיזון	H-0396 10		10 מיקרוגרם
Triiodo-thyronin	T-5516		0.0065 מיקרוגרם
עוברית ** בסרום שור			5% או 15%	-80 ° C

טבלה 1. האדם עוברית בינוני הרשתית רכיבים עבור הכנת בינונית 500 מ"ל

THT * מיוצר על ידי המסת טאורין, הידרוקורטיזון-triiodo-thyronin ב -1 1.5 מ"ל PBS לפני ביצוע בינוני. Aliquots מרובים עשויים ומאוחסנים ב -80 ° C כדי לפשט את ההכנה culturing של המדיום לתרבות.

** בסרום שור עוברית לא מתקבל סיגמא אולדריץ או Gibco.

בסרום שור עוברית המשמש להכנת התקשורת מתקבל מאטלנטה הביולוגיים (Norcross, GA). כל בקבוק סרום הוא מובטל חום (56 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות) לפני השימוש. כדי להבטיח עקביות תרבית תאים כמויות גדולות של נסיוב ממגרש אותו נרכשים ומאוחסנים -20 מעלות צלזיוס עד שהם משמשים להכנת התקשורת. תאים seeded בדלילות מ אצווה מסוים של תאים hfRPE מגדלים 24 - או 12 - צלחות היטב במשך כמה שבועות בכלי התקשורת המכיל 20% FBS מתוך המון שונות. התאים melanated הצמיחה המהירה ביותר עם המורפולוגיה הרשתית הקלאסית ביותר (המרוצף) עולה הרבה נסיוב מתאים שניתן להשתמש בהם עבור תרבית תאים.

תרבות בינוני תא מכיל גם: N1 תוספת (סיגמא אולדריץ) 1:100 מ"ל / מ"ל, GlutaMax / פניצילין-סטרפטומיצין 1:100 מ"ל / מ"ל ​​(Gibco), חומצה אמינו חיוניות פתרון (סיגמא אולדריץ) 1:100 mL / מ"ל. בנוסף, הידרוקורטיזון (20 מיקרוגרם / ליטר), טאורין (250 מ"ג / ליטר), ו-triiodo thyronin (0.013 מיקרוגרם / L) (THT) מוכן מראש על ידי המסת שלושת המרכיבים האלה ב PBS לריכוז סופי של 1:500 (מ"ל / מ"ל). Aliquots של THT מאוחסנים הוסיף 80 ° C עד למדיום הרשתית.

3. תא תרבות

על קבלה, גלובוסים שלמים הם שטופים בתמיסה antimycotic אנטיביוטי (בדילול מלא עד 10X,.. החתול לא 15240-096; Invitrogen) בתוספת גנטמיצין (1 מ"ג / מ"ל) למשך 3 עד 5 דקות (איור 1 להלן).

באיור 1. אנטיביוטיקה לאחר דגירה הם שטפה פעמיים עם מדיום כגון HBSS או PBS. אחת הגלובוס עין בזמן מועבר צלחת פטרי עם 10 ס"מ מצופה Sylgard-184 (WPI) ומאובטחת עם 27G מחטים. בעזרת סכין חדה sideport (Alcon) מבצעים חתך דרך בלובן העין למטה בגוף ריסי (1 / 3 של המרחק מקו המשווה עין אל פני השטח הקדמי). חתך זה משמש להתחיל לחתוך מעגלי להסרת החלק הקדמי בעין. לחתוך זה נעשה באמצעות טונגסטן קרביד מספריים מצופה מעוקל אירוס עם להב משונן (FST). לפני הסרת החלק הקדמי של העין, לחתוך נעשית דרך הגוף הזגוגי, כדי למנוע ניתוק retina מן הרשתית בקוטב האחורי. לאחר החלק הקדמי של העין מוסר, מוט האחורי הוא מודגרות עם פתרון dispase-I (2 U / mL, החתול לא 04942086001:.. Roche Diagnostics, אינדיאנפוליס, IN) ב 5% בינוני המכילה סרום במשך 40-60 דקות ב 37 ° C-5-CO _2%. לאחר הטיפול dispase, עמודי האחורי מועברים HBSS בצלחות פטרי עם ריפוד סיליקון (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI) ו גזור לתוך הרביעים או חתיכות גדולות מספיק כדי להשתטח רקמות. ואז הרשתית מוסרת בעדינות עם מלקחיים. תא בודד שכבות הרשתית היו והתקלף ואסף ישירות לתוך פתרון טריפסין-EDTA (Gibco, # 25200-056) קר. אחרי הרשתית נאספים, צינורות עם רקמות טריפסין-EDTA אטומים ומועברים לתוך אמבט מים במשך 10-15 דקות על 37 ° C. לאחר 10 דקות של דגירה, הצינורות הם מזועזעים במרץ להפריד הרשתית בצבירים קטנים. אם ההפרדה אינה שלמה, צינורות ממוקמים חזרה לעוד 5 דקות לתוך אמבט מים. לאחר דגירה טריפסין-EDTA, הצינורות נבדקות עבור בלתי אפשרי מומס אשכולות תא מעורבת. אשכולות כל נצפתה מוסרים באמצעות קנס היטה זכוכית פיפטה פסטר. אחרי סיבוב כלפי מטה (1.4 סל"ד על צנטריפוגה קליניים 4 דקות), הם תאים hfRPE מחדש תלויה התקשורת הרשתית 15% ולאחר מכן להכניס Primaria צלוחיות (לדוגמה: חתול לא 08-772-45; פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה.. ). בינוני זה הוחלף אחרי יום 1 בינוני עם סרום המכיל 5% הרשתית, שינויים שנעשו לאחר מכן כל 2 עד 3 ימים. לאחר 3 עד 4 שבועות, התאים הפכו ומחוברות ו פיגמנט אחיד. הם trypsinized אז 0.25% טריפסין-EDTA במשך 10 עד 15 דקות, שוב תלוי 15% סרום המכיל תא הרשתית בינוני תרבות, seeded מוסיף על התרבות ברור התא 150 עד 200K לכל התאים היטב (Transwell; קורנינג שחקן המשנה, קורנינג, ניו יורק), באמצעות 12 מ"מ קוטר מוסיף, נקבוביות 0.4-אממ, קרומי פוליאסטר (לדוגמה: חתול לא 07-200-161, פישר סיינטיפיק)... לפני זריעה, בארות היו מצופים תאי מטריקס אדם (10 מיקרוגרם ב 150 HBSS μL לכל טוב, החתול לא 354237:.. BD Biosciences, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי) ו נרפא עם האור האולטרה סגול בשכונה למשך 2 שעות. במקרים מסוימים, ההליך trypsinization חזר על עצמו בפעם השנייה, כדי לאסוף את התאים לא לנתק אחרי trypsinization הראשונה. הפרוטוקול זהה (למעט ציפוי עם ECM) שימש תאים התרבות על צלוחיות כדי ליצור את האוכלוסייה P1 של תאים. תאים אלו שימשו הניסויים כאשר היה להם התנגדות רקמות סך של 200 ≥ Ω • ² ס"מ והיו פיגמנט אחיד.

אנא לחץ כאן דמות גדולה 1 .

4. צעד אחר צעד נהלים

1. הכן 12 גם צלחת עם פתרונות מרובים (עבור כל עין 4 בארות הצורך):
   1. להוסיף 10x פתרון antimycotic אנטיביוטי - 1 טוב / עין
   2. להוסיף PBS / HBSS פתרון לשטוף - 2 בארות / עין
   3. להוסיף פתרון dispase - 1 טוב / עין
2. הכינו צלחת פטרי לנתח ידי הוצאת 5 מחטים קיבעון וממלאים אותו עם HBSS
3. העיניים הוצא ולמקם אותם לתוך פתרון לאנטיביוטיקה antimycotic במשך 3-5 דקות (מוכן בשלב 1)
4. יש לשטוף את העיניים שתי בארות (מוכן בשלב 1) עם PBS / HBSS, ולאחר מכן להעביר אותם לנתח צלחת.
5. שריר מוגזם חתוך ורקמות החיבור סביב העין
6. שימוש במחטים 27G מאובטח (להצמיד את בסיס סיליקון) עיניים לנתח צלחת יישור אותם באופן שבו הקרנית פונה כלפי מעלה.
7. בעזרת סכין sideport לעשות חתך מתחת הקרנית, שם חתך עגול יתחיל
8. בעזרת מספריים לחתוך את איריס סביב העין, ולאחר מכן באמצעות מספריים לחתוך אותו זגוגי ולהרים החלק הקדמי של העין משם.
   הערה: צעדים 3-8 למנוע לחץ מכני מוגזמת גלגל העין.
9. העברת העין פתוח בפתרון dispase (מוכן בשלב 1)
10. דגירה כוס עין 40-60 דקות 37 ° C עם 5% CO ₂
11. החלף פתרון HBSS ב לנתח צלחת עם אחד טרי.
12. העברת העין מפתרון dispase לצלחת לנתח.
13. מיקום העיניים בצלחת פטרי (כוס גלגל העין כלפי מעלה) ובטוחה עם שתי מחטים 27G.
14. הרם בעדינות הרשתית מופרדים חלקית באמצעות מספריים לחתוך ברשתית הרשתית הרחק עצב הראייה. בטל הרשתית.
15. בעזרת מספריים איריס לעשות אחד חתך מהפריפריה של העין כלפי עצב הראייה.
16. שימוש בכל חמשת המחטים 27G לשטח ביצוע בעין הרשתית שכבת נמתח יפה.
17. בעזרת מספריים הרשתית לעשות חתך עגול סביב עצב הראייה הפרדת השכבה הרשתית מן המצורף עצב הראייה.
    הערה: שלבים 13-17 ניתן לעשות עם הגדלה נמוכה או בלי מיקרוסקופ סטריאו
18. התאם stereomicroscope כדי הגדלה 250xאו יותר למצוא את קצה הסדין הרשתית קרוב עצב הראייה לאורך החתך שנעשו על ידי איריס מספריים.
19. השימוש בשתי מלקחיים קרום הנפרד של הרשתית, ברוך משכבת ​​רקמות כורוידאלית. זה עשוי לדרוש כמה ניסיונות כדי למצוא שטח בשולי שם את החיבור של הרשתית ואת דמית העין היא החלשה ביותר.
20. הרשתית מקום הסדינים לתוך פתרון טריפסין-EDTA קר בצינור 15 מ"ל
21. אחרי הרשתית נאספים, צינורות כובע ולהעביר עם רקמות טריפסין-EDTA לתוך אמבט מים במשך 10-15mins על 37 ° C.
22. לאחר 10 דקות של דגירה, 15 במרץ לנער צינורות מ"ל להפריד הרשתית בצבירים קטנים. אם ההפרדה אינה שלמה, במקום צינורות לתוך אמבט מים עוד 5 דקות.
23. בדוק את הצינורות עבור בלתי אפשרי מומס אשכולות תא מעורבת. אשכולות כל נצפתה יש להסיר באמצעות קנס היטה זכוכית פיפטה פסטר.
24. ספין למטה (1.4 סל"ד על צנטריפוגה קליניים 4 דקות) תאים hfRPE, להסיר supernatant מחדש להשעות התאים 15% התקשורת הרשתית (9 בסך הכל מ"ל)
25. שים 3 מ"ל של השעיה התא לתוך צלוחיות Primaria להוסיף 2 מ"ל של 15% התקשורת הרשתית טריים, בקבוק למקום לתוך החממה עד למחרת היום (37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂₎

5. נציג תוצאות

אימות פונקציונלי של תרבית תאים hfRPE

בניסויים הקודמים השתמשנו אלה תרבויות העיקרי לקביעת, קיטוב ביטוי ותפקוד של חלבונים תחבורה פלזמה קרום ולזהות מסלולי איתות ספציפיים המווסתים את תפקוד הרשתית ^1-11 מאפיינים אלה כפי שהם צברו לספק אימות ערכה של מאפיינים שניתן להחיל לדור כל תא. הניסויים סיכם מתחת לזהות את החלבונים הקובעים תחבורה נוזל transepithelial ואת שלמות של מסלול paracellular. אלה בניסויים במבחנה אומתו במודל חיה של הרשתית מחדש שחיבור ^6.

איור 2. לוקליזציה של CFTR בתאים hfRPE הפאנל העליון משמאל:. CFTR זוהתה בתאי hfRPE באמצעות קרום מועשר בתמציות. M, משקל סמן מולקולרי: מסלול 1, בוגרת הגדולים (הלהקה C) בוגר (להקות A ו-B) במרכז הפאנל התחתון: לוקליזציה immunofluorescence של CFTR (תווית ירוקה) הפאנל הימני למעלה: צלב מוגדל סעיף להציג דרך מישור z מראה.. מקסימום בעצימות הקרנת דרך Z-ציר. ההסתדרות הציונית-1 (שכותרתו אדום) משמש כסמן צומת הדוק המגדירה הצדדים apical ו basolateral של הרשתית. DAPI (כחול) תוויות גרעיני הממוקם סמוך ממברנת הבסיס. ההסתדרות הציונית-1 נראה צהוב / כתום, מאז פלואורסצנטי ירוק חופף האדום תווית של CFTR.

איור 3. IFNγ-Induced שינויים פיזיולוגיים אצל hfRPE:. תוספת של IFNγ לאמבטיה הבסיס גדל התחבורה נוזל transepithelial (J v) ברחבי monolayer של תאים ראשוניים hfRPE תרבותי J v הוא זמם כפונקציה של הזמן עקבות העליון נוזל נטו. קליטה (apical לאמבטיה הבסיס) הוא הצביע על ידי ערכים חיוביים; פוטנציאל transepithelial (TEP) התנגדות רקמות מוחלט (R _T) נרשמות כפונקציה של הזמן את עקבות התחתונה. ב ': תוספת של CFTRinh-172 (5 מיקרומטר) לאמבטיה הבסיס עכבות IFNγ-מגורה להגדיל J V.

להלן דוגמה של מודל ניסויים בבעלי חיים המאשר hfRPE הממצאים חוץ גופית. בניסוי זה, ניתוק הרשתית שנוצרו באופן מלאכותי צומצם משמעותית לאחר תוספת של IFNg למשטח העין החיצוני (איור 4 A, B). אפקט זה יכול להיחסם חלקית על ידי: (1) תוספת של חוסם cAMP (איור 4D); (2) חסום לחלוטין לאחר תוספת של Jak חוסמי ⁺ המחנה. להלן תמונות מתקבלים באמצעות סורק אוקטובר

איור 4. Vivo ניסויים ניתוק הרשתית. הנהלים עבור אלה בניסויים vivo תוארו בעבר בפירוט ^6. בניסויים אלו, נוצרו פלוגות הרשתית בעין חולדה על ידי הזרקה של 0.5-3 μL של פתרון PBS שונה לחלל subretinal (SRS), לבד או עם שילוב של Jak-STAT ו מעכבי PKA מסלול. הניסוי היה כל תקופת השליטה הראשונית של 40-70 דקות לאחר הקמתה של ניתוק הרשתית. במהלך תקופה זו, שיעור השינוי של נפח בועה נמדדה על מנת להבטיח יציבות בועה. טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית הדמיה (המכון לפיזיקה יישומית, רוסית האקדמיה למדעים, ניז'ני נובוגרוד, רוסיה) שימש למדידת כמובן זמן לשנות את עוצמת הקול ב-SRS.

הקורס פעם מחדש מצורף כרךהשינוי Ume נמדדה על ידי טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (אוקטובר). אוקטובר תמונות מתוך 4 ניסויים שונים (לוחות משמאל; לספירה) מראים כי שינוי בגדלים ניתוק (החצים A, B, ו-D) בעקבות תוספת של IFNγ אל פני השטח הקדמי של 40-70 דקות. לוחות A ו-B להראות כי IFNγ JV גדל משיעור שליטתה (μl ≈ 2 ס"מ • ² • hr ^-1) עד 14 ו - 12 ס"מ ² μl • • hr-1, בהתאמה. בעקבות תוספת של Jak-STAT מסלול ו PKA מעכבי (C ו-D), את IFNγ - שיעורי הקליטה המושרה הופחתו משמעותית 0.2 ו - 7.9 ס"מ μl • ² • hr-1, בהתאמה. חצים מציינים את הגבול של בועה, לצורך השוואה עם שטח מגודר בתוך הקו מקווקו, (נפח ההתחלה). בצד ימין של הדמות: גבי הפאנל-סיכום נמדד שיעור JV מתוך מספר ניסויים, באמצע הפאנל-הסרט ( לחץ כאן ); הפאנל-3D נמוך קטעים של הניסוי לסכם ב Pseudocolor בכחול מציין במידה המרחבי של ניתוק בזמן t = 0 40 דקות אחרי תוספת של INFγ.

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם האגודה לחקר חזון הצהרה עיניים. פרוטוקול שאושר על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש של מכוני הבריאות הלאומיים.

דיון

בניסויים הנוכחי, אנו מתארים שינויים נוספים של טכניקות שפורסמו בעבר שלנו ³ נועד לייעל את הצעדים הדרושים כדי לייצר מספר רב של תרבויות העיקרי hfRPE עקבית עם מספרים גבוהים יותר של תאים זמינים לכל עין. כל שינוי בהליך המקורי נבדק בקפדנות בפיזיולוגיה מספר ניסויים בביולוגיה מולקולרית על מנת להבטיח כי השינויים לא להכניס חפצים נבדקות ללא הרף על ידי מעבדות רבות אחרות באמצעות תאים אלה. לבסוף, ניסויים נוספים בוצעו להשוות את בתוצאות חוץ גופית כדי הפרעות דומות בבעלי חיים.

חומרים