בדיקת גמישות מוחית חוץ גופית של הלבלב: חקר שינויים בנוירונים במערכת העיכול שנחשפו לתמציות רקמת לבלב אנושיות בריאות וסרטניות

תקציר

מקור: Demir, I. E., et al. Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay. J. Vis. Exp. (2014).

סרטון זה מדגים בדיקת נוירופלסטיות חוץ גופית כדי לחקור את השינויים המורפולוגיים בגרעיני השורש הגבי ובתאי עצב מקלעת מיאנטריים שנחשפו לתמציות רקמת לבלב אנושיות בריאות וסרטניות. בדיקה זו מאפשרת לנו לחקור את צמיחת העצבים, דפוס ההסתעפות והגודל העצבי.

פרוטוקול

1. בידוד נוירונים

לאחר סיום איסוף התמצית/סופרנטנט, המשיכו בבידוד הנוירונים.

1. עבור תאי עצב מסוג DRG, אספו את ה-DRG הצווארי עד המותני של חולדות שזה עתה נולדו בין היום שלאחר הלידה (P) 2-12 לאחר עריפת ראשים ודיסקציה סטריאומיקרוסקופית של DRG (איור 1A). על מנת שיהיו מספיק נוירוני DRG עבור צלחת של 24 בארות, אספו את כל DRG צוואר הרחם עד המותני של חולדה אחת שזה עתה נולדה (שווה ערך ל-52 DRG) לכל צלחת.
2. חתכו את ההקרנות ההיקפיות (העצביות) והמרכזיות (שורשים) של DRG באמצעות מיקרומספריים. השארת התחזיות במקומן מעכבת טריטורציה ומגדילה את הסיכון לזיהום של תרבית על ידי פיברובלסטים.
3. עבור תאי עצב מסוג MP, חתכו את המזנטריה מהמעי הדק והפשיטו באופן ידני וזהיר את השכבה הסרומוסקולרית של המעי הדק (לפרוטוקול מפורט על בידוד MP, איור 1B). עבור MP, לאסוף את המקלעת משתי חולדות לכל צלחת 24-well.
   הערה: נסו להיות עדינים ככל האפשר על מנת למנוע קרעים בשכבה הסרומוסקולרית מכיוון שהם מעכבים את ההפרדה המוצלחת שלה מהמעי הדק.
4. יש לאסוף את שכבת ה-DRG והשריר בתווך חיוני מינימלי קר כקרח (MEM) המסופק עם גנטמיצין (20 מ"ג במדיום 500 מ"ל) ומטרונידזול (2.5 מ"ג במדיום 500 מ"ל).
5. לאחר איסוף DRG, דגרו עליהם בתמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) המסופקת עם collagenase Type II למשך 20-30 דקות. לבידוד MP, דגרו בסוג קולגנאז בין שעה לשלוש שעות, בהתאם לגיל החיה (איור 1C).
6. עבור MP, אספו את חתיכות ה-MP דמויות הרשת תחת סטריאומיקרוסקופ והעבירו ל-MEM קר כקרח.
7. לאחר מכן triturate DRG ו- MP דרך מזרקים עם קוטר יורד.
   הערה: טריטורציה מוגזמת יכולה להרוס את תאי העצב, אבל פחות את תאי הגלייה.
8. לאחר שהתווך המכיל את ה-DRG או ה-MP נעשה עכור, צנטריפוגו את המתלה במהירות של 93.9 x גרם למשך 5 דקות, השליכו את התווך והשהו מחדש בתווך נוירובזאלי (בתוספת 100 U/ml פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 0.5mM L-גלוטמין ו-2% B-27).
9. לספור את המספר הכולל של תאים (כלומר נוירונים וגליה) באמצעות hemocytometer.
   הערה: מספר התאים הדרושים תלוי בפרמטר המדידה. כדי לכמת את צפיפות הנוירוטים, יש צורך בתרביות צפופות יותר ולכן במספר גדול יותר של תאים מאשר למדידת צמיחת נוירוטים, גודל פריקריונלי ותבנית הסתעפות של נוירונים בודדים. למדידות צפיפות נוירונים, השתמשו למשל ב-10,000 תאים (נוירון+גליה)/באר או ב-1,500 נוירונים/באר. עבור מורפומטריה על נוירונים בודדים, טריפסיניזציה קצרה (בת דקה) של תאים וזריעה של 2,500 תאים/באר או 400 נוירונים/באר מומלצת. היבול הטיפוסי של תאים המתקבל מחולדה אחת הוא בסביבות 300,000-500,000 תאים.
10. זרעו את התאים על כיסויים בקוטר 13 מ"מ שצופו בלילה הקודם, ומעליהם הבארות במדיום נוירובזאלי (בתוספת 100 U/ml פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 0.5 mM L-גלוטמין ו-2% B-27) (איור 1D).
    הערה: יש להשתמש בפולי-די-ליזין (40 מ"ג/מ"ר²) או בכיסויים מצופים אורניתין ולמינין (1 מ"ג/מ"ל כל אחד). תאים נצמדים לפולי-D-ליזין מהר מאוד, ולכן הוא מתאים לניסויים שבהם נדרשים תאים רבים (כלומר מדידות צפיפות נוירוטים). ההתקשרות ללמינין היא באופן כללי מעט חלשה יותר, אך למינין הוא מקדם חזק של צמיחת נוירוטים. לכן, למדידות על הסתעפות עצבית ואורך עצבי, העדיפו ציפוי אורניתין/למינין.
11. אפשרו לתאים להיצמד לבארות למשך הלילה. למחרת, הכינו את החומר המוסף בתמצית (בריכוז סופי של 100 מק"ג/מ"ל).
12. שאפו את מצע הזריעה, ובצעו שטיפה אופציונלית עדינה מאוד עם PBS, ולאחר מכן בצעו באיטיות פיפטה של חומר התמצית/תוספת הסופר-נטנט (איור 1E).
13. תנו לתאים לגדול במשך 48 שעות. שאפו את המדיה וקבעו 4% פרפורמלדהיד לצביעת מערכת החיסון (איור 1F).
14. בצעו צביעה כפולה של מערכת החיסון באמצעות סמנים ספציפיים לתאי עצב (למשל בטא III-טובולין) וספציפיים לגליה (למשל חלבון גליה פיברילרי חומצי/GFAP) (איור 1G).
15. לצורך מורפומטריה, השתמשו במיקרוסקופ אור הפוך המצויד במצלמת CCD בשילוב עם תוכנה אוטומטית המאפשרת מדידה של צפיפות הנוירונים (ראו טבלה).
16. צפיפות הנוירוטים של תרביות עצביות נמדדת על 4-5 פוטומיקרוגרפים מייצגים בהגדלה של פי 200 מ-4 אזורים שונים של צמיחה צפופה ביותר בכל כיסוי על ידי כיסוי רשת של 50 מיקרומטר x 50 מיקרומטר וספירת צפיפות הסיבים לריבוע הנמדדת בסיבים המצטלבים. צמיחת נוירוטים, מספר ממוצע של ענפים לכל תא עצב, אורך הענף הממוצע והגודל הפריקריונלי יכולים להימדד מ-30 תאי עצב בודדים שנבחרו באופן אקראי מכל כיסוי, על-ידי סימון הנוירוטים והפריקריה (איור 1H).

תוצאות

איור 1. פרוטוקול סכמטי של בדיקת נוירופלסטיות חוץ גופית. הבדיקה הנוכחית עושה שימוש בתאי עצב של גרעיני שורש גבי של חולדה שזה עתה נולדו (DRG) ומקלעת מיאנטרית (MP) כדי לחקור את ההשפעה של תמציות רקמת לבלב או סופרנאטנטים של תאים על מורפולוגיה עצבית וגלייה. DRG נאספים לאחר כריתת למינקטומיה קדמית ושכבה סרומוסקולרית המכילה MP לאחר כריתה והפשטה מכנית של המעי הדק (A, B). לאחר עיכול co...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פולי-D-ליזין הידרוברומיד	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 1149
אורניתין/למינין	סיגמא-אולדריץ'	P2533/L4544
13 מ"מ כיסויים	מרק		לשימוש בצלחת 24 בארות
Dismembranator S	סרטוריוס
נוגדן אנטי-בטא-III-טובולין	מיליפור	MAB1637	ריכוז 1:200
נוגדן נגד GFAP	דקו	M0761	ריכוז 1:400
מאגר RIPA + מעכב פרוטאז			כל ספק
מדיום נוירובזאלי	גיבקו/מדעי החיים	21103-049
תוספת B-27	גיבקו/מדעי החיים	17504044	איכות B-27 ידועה כתלויה במספר המגרש
גנטמיצין/מטרונידזו			כל ספק
מדיום חיוני מינימלי	גיבקו/מדעי החיים	31095-029
תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS)	גיבקו/מדעי החיים	24020133	משפר את פעילות collagenase כאשר מכיל Ca/Mg
קולגנאז סוג II	וורת'ינגטון ביוכימיה	CLS-2	להשיג מגרשים עם לפחות 200 U/mg פעילות
טריפסין-EDTA 0.25%	גיבקו/מדעי החיים	25200056
4% פרפורמאלדהיד			כל ספק
תוכנת דוקו AnalySIS	אולימפוס