1. הכנת תרבית תאים ומערך ניסויי
- יש לשמור על תאי סרטן המעי הגס האנושיים, HCT-116 לפי המלצת הספק, בחד-שכבותב-75 ס"מ 2 צלוחיות תרבית המכילות 10 מ"ל של נוסחת McCoy 5a Medium Modified, בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ותמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית 1%.
- לגדל תאים בסביבה לחה של 5% CO2 ב 37 ° C עד 70% מפגש עם התחדשות בינונית כל 2 עד 3 ימים.
- כדי להשיג קרן BNCT (למשל, קרן נויטרונים בתוספת BPA) ואפקט BNCT של הרג תאים סרטניים כחלקיקים כבדים ולהפקיד את רוב האנרגיה שלהם בתוך התאים הסרטניים המכילים בור, יום לפני הקרינה, הוסף חומר העברת בור למדיום תרבית התא – למשל, 10BPA, 4-Borono-L-פנילאלנין (10 מיקרוגרם 10B/mL, 0.925 מילימטר סופי) 12-16 שעות (ספיגה מרבית של בורון) לפני ההקרנה.
הערה: אם אתה משתמש בקו תאים אחר, שלגביו אין נתונים במקרה של מחקר BNCT, בדוק את ספיגת הבור עבור כל קו תא כדי להשיג ריכוז בור אופטימלי. מדוד את ספיגת תאי BPA על ידי ספקטרוסקופיית פליטה אופטית פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICP-OES) כפי שבוצעה על ידי קבוצת Dagrosa.
- לאחר 12-16 שעות של אספקת בור, לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים עם 10 מ"ל של 1x PBS. לאחר מכן טריפסינזציה של התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA לתאים ודגרה במשך 5 דקות ב 37 ° C כדי לשפר את ניתוק התא. כאשר תאים מתחילים להתנתק, להפסיק את פעולת טריפסין על ידי הוספת 10 מ"ל של מדיום שלם.
- יש לשאוף את תרחיף התא בצינור של 15 מ"ל ולספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי על ידי הוספת 10 μL של 0.4% טריפאן כחול ל-10 מיקרוליטר תאים, לערבב ולצטט 10 μL בשקופית ספירה. לדלל את תרחיף התא לריכוז של 1 x 106 תאים/מ"ל של המדיום. Aliquot 1 מ"ל של השעיית התא לכל cryotube.
- הכינו דוזימטרים תרמו-לומינסנטיים (TLDs) למדידת מנות קרני גמא ורדידי זהב לשטף נייטרונים וחברו TLDs לצינורות הקריו-צינור או לבקבוק תרבית התא לפני הקרינה.
- הקרינו את 1 x 106 תאים/מ"ל עם הקרן המעורבת בנייטרונים בשטף נייטרונים תרמי מינימלי מומלץ של 5.9 x 1011 (n/cm-2 min-1)4 בצלוחיות תרבית או בצינוריות קריו, בהתאם ליכולות המתקן.
הערה: הגדר את זמן הקרינה לפני כדי לקבל שטף נייטרונים מומלץ.
- לאחר הקרנה, זרע 1 מ"ל של תאים מוקרנים (1 x 106 תאים / מ"ל) על 22 x 22 מ"מ מכסה מחליקים בצלחות פטרי 35 מ"מ או צלחות 6 באר, להשלים עם 2 מ"ל של המדיום הנדרש. יש לדגור על תאים למשך 3 שעות לכל היותר בטמפרטורה של 37°C בסביבה לחה של 5% CO2 כדי לאפשר להם להיצמד לכיסויים. התבונן בהתקשרות של תאים מעת לעת תחת מיקרוסקופ הפוך עם 20x objective.
הערה: עבור תאי HCT-116, הצפיפות המינימלית היא 600,000 תאים לזרע. להליך צביעה מהיר נוסף, השתמש בשקופיות התא, הפחת את צפיפות התאים בהתאם.
2. קיבוע תאים
- לאחר הקרנה ודגירה של תאים, להסיר את המדיום מן התאים המחוברים ולשטוף תאים פעם אחת עם 2.5 מ"ל של PBS.
- תקן תאים עם 1 מ"ל של 70% אתנול למשך 10 דקות ב- RT.
הערה: לחלופין, יש להשתמש ב-1%-3.7% פרפורמלדהיד (PFA) לקיבוע כפי שהומלץ קודם לכן. הפרוטוקול מושהה כאן. אחסנו תאים קבועים באתנול במקפיא בטמפרטורה של -20°C למשך לא יותר ממספר שבועות לצורך ניתוח נוסף וצביעה אימונופלואורסצנטית.
3. חלחול תאים
- לאחר הקיבוע, להסיר אתנול מן צלחת פטרי לשטוף עם 2.5 מ"ל של 1x PBS.
הערה: אין לתת לתאים להתייבש בין שלבי השטיפה.
- הוסיפו בעדינות 1 מ"ל של 0.2% של Triton X-100/PBS כדי לכסות את הכיסויים בתאים בצלחות פטרי.
- לדגור במשך 5 דקות ב RT.
- לשטוף את התאים 3x עם 2.5 מ"ל של 1x PBS.
הערה: הגדל את אחוז Triton X-100 ב- PBS עד 0.5% במידת הצורך (יותר מוקדים ניתנים לזיהוי, תלוי בקו התאים שנבדק). בצעו שטיפות נוספות עם PBST (PBS עם 0.5% טווין) כדי למנוע קשירה לא ספציפית.
- חסום את שלב החדירה עם 1 מ"ל של 2% BSA (אלבומין V של סרום בקר) מדולל ב- PBS ודגר במשך מינימום של 30 דקות או שעה אחת עם 1% BSA.
הערה: שלב זה ניתן להשמיט והוא תלוי בסוג הנוגדן בשימוש. לחלופין, השתמש ב- 5% FBS כמומלץ.
4. צביעה אימונופלואורסצנטית
- הוסף את הכמות המתאימה של נוגדן ראשוני (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs ו- Anti-Rad52) מדולל ב- PBS עם BSA (אלבומין V של מקטע סרום בקר 2%) כפי שהומלץ (ראה טבלה 1 עם דילולים מומלצים) (דרושים 100 מיקרוליטר לדגימה).
| נוגדן ראשוני | פונקציה | דילול מומלץ | אחסון [°C] |
| אנטי-ɣ-H2AX | זיהוי DNA-DSB | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| אנטי-DNA-PKcs | זיהוי RIFs של חלבון DNA-PKcs השייך ל- NHEJ | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| אנטי-ראד52 | זיהוי RIFs של חלבון Rad52 השייך ל-HRR | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| נוגדן משני | | להיות לא מיודע | |
| נוגד עכבר IgG FITC | מוקדי ɣ-H2AX | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| עז נגד ארנב IgG H&L (Alexa Fluor 488) | עבור NHEJ ו- HRR תיקון חלבונים מוקדים | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
טבלה 1: דילולים מומלצים והערות לשימוש בנוגדנים המשמשים בסעיף
- מכסים את צלחת הפטרי כדי לשמור על הלחות בקופסת פלסטיק עם ליגנין לח באמצעות מים מזוקקים ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. הדגירה יכולה להתבצע ב 4 °C (75 °F) למשך הלילה.
- לאחר הדגירה, בצע 3 שטיפות עם 2.5 מ"ל של PBS.
הערה: אין לאפשר למגלשה להתייבש במהלך שלבי השטיפה.
- הוסף את הכמות המתאימה של נוגדן משני (נגד עכבר IgG FITC, עז נגד ארנב IgG (Alexa Fluor 488) מדולל PBS עם BSA (ראה טבלה 1) (100 μL נדרש לכל דגימה). עבור צעד זה ואת השלבים הבאים, לעבוד בחושך.
- מכסים שוב את צלחת הפטרי כדי לשמור על הלחות בקופסת פלסטיק עם ליגנין לח ודגרים למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
- לאחר הדגירה, לבצע 3 שטיפות עם 2.5 מ"ל של PBS.
- הוסף 100 μL של DAPI מדולל ב- PBS לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל כדי להכתים את הגרעינים.
- יש לדגור תוך זמן קצר למשך 2 דקות לכל היותר ב-RT.
- לאחר הדגירה, לבצע 3 שטיפות עם 2.5 מ"ל של PBS.
- הסר את PBS ושים בעדינות כיסוי על החלק העליון של אמצעי ההרכבה, הימנעות היווצרות של בועות אוויר, ואטם את הקצוות של הכיסוי עם לק. מחכים עד שהלכה תתייבש וצובעים את הכיסוי.
- המתן להתקשות אמצעי ההרכבה (עד 3 שעות) לפני ניתוח התמונה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. אחסנו מגלשות זכוכית בקופסת פלסטיק בטמפרטורה של 4°C בחושך.
