בדיקת פוספטאז בתאי CRC: שיטה לבחינת מצב הזרחן של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס

תקציר

מקור: Huda, M. N., et al. בדיקה עבור זרחן וקשירת מיקרוטובולים יחד עם לוקליזציה של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מתאר פרוטוקול להערכת מצב הזרחן של חלבון טאו על ידי בדיקת פוספטאז בתאי סרטן המעי הגס. אנזים פוספטאז פועל על קבוצות הפוספט הקיימות על חלבון טאו, ומגביר את הניידות של חלבון טאו בג'ל SDS PAGE בהשוואה לדגימות חלבון טאו שלא טופלו.

פרוטוקול

1. בדיקת פוספטאז

1. טפלו בליזטים של התא כאשר התאים מגיעים למפגש ~65% (בקירוב באמצעות מיקרוסקופיה), הסירו את תוספת ה-MEM והוסיפו MEM ללא סרום עם 5 מיקרומטר, 10 מיקרומטר ו-30 מיקרומטר כורכומין או 25 מילימול, 50 מילימטר ו-100 מילימטר LiCl. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 24 שעות באטמוספירה לחה המכילה 5%_CO2, 24 שעות לאחר הטיפול, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל מלח חוצץ פוספט קר כקרח (PBS), ולגרד את התאים באמצעות מגרד תאים. העבירו את התאים המרוטשים לצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל וצנטריפוגות למשך 4 דקות בטמפרטורה של 1,800 x גרם ב-4°C כדי לקבל כדורי תאים. לצבוע את התאים על ידי השעיית הכדוריות ב 100 μL של חיץ RIPA מלא ב 4 ° C במשך 20 דקות תוך הקשה קבועה על הצינורות. הסר את הדגימות בקצרה. צנטריפוגה התא הומוגנטים בצנטריפוגה benchtop ב 22,570 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C. להעביר את supernatants לצינורות מסומנים אחרים באמצעות פיפטה) עם phosphatase אלקליין במאגר phosphatase אלקליין.
   1. הן לדגימות בקרה והן לדגימות מטופלות, הכינו דגימות של 20 מיקרוליטר המכילות 20 מיקרוגרם חלבון בסך הכל. הוסף את נפח התא lysates המכיל 20 מיקרוגרם חלבון סה"כ, ואחריו 2 μL אלקליין phosphatase buffer ו 10 μL phosphatase אלקליין. מוסיפים מים מזוקקים כדי ליצור 20 μL.
2. יש לדגור על הדגימות בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת. עצור את התגובה על ידי הוספת חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) בריכוז סופי של 50 mM, או על ידי הוספת נתרן orthovanadate (Na₃VO₄) בריכוז סופי של 10 mM. ניתן לעצור את התגובה גם על ידי חימום ב 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
3. לפני הדגירה של דגימות עם phosphatase מסיים, להכין דגימות של אותו ריכוז מבלי להוסיף phosphatase להשוואה עם דגימות שטופלו phosphatase.
4. הוסף את מאגר טעינת הג'ל 4X SDS שהוכן לאחרונה המכיל 400 mM DTT.
5. יש לדגור על הדגימות על בלוק חום בטמפרטורה של 100°C למשך 5 דקות. מערבבים את הדגימות באמצעות מערבולת. מצננים בטמפרטורת החדר למשך ~10-15 דקות.
6. הרכבת מערכת אלקטרופורזה להפעלת ג'ל 10% פוליאקרילאמיד על ידי SDS-PAGE.
   1. יש להעמיס 10 מיקרוגרם חלבון (דגימה של 13 μL) לכל באר על ג'ל 10% פוליאקרילאמיד. העמיסו על סולם המשקל המולקולרי.
   2. לאחר טעינת הדגימה, חבר את האלקטרודות החיוביות והשליליות של מערכת האלקטרופורזה למקור חשמל כדי לשמור על מתח קבוע. בתחילה, התחל ב 70 V למשך 20 דקות כדי להעביר את דגימות החלבון מג'ל הערימה לתוך ג'ל הפתרון. לאחר מכן, הגדל את המתח ל 125 V והפעל את הג'ל במשך כ 70-120 דקות עד דגימות וסולם חלבון להגיע לסוף הג'ל.
   3. לאחר השלמת האלקטרופורזה, מעבירים את הג'ל לקרום PVDF באמצעות מערכת אלקטרובלוטינג רטובה. העברה במשך ~ 100 דקות ב 100 V.
   4. סמן את הכתם על ידי ביצוע חתך קטן בצד סולם המשקל המולקולרי. השתמש יריעת פלסטיק שקופה חותך חד לחיתוך הכתם.
7. חסום את הממברנה במאגר חוסם BSA 4% למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
8. לדגור את הכתם בתמיסת נוגדנים ראשונית (אנטי-טאו בקנ"מ 1:5,000) ב-4°C למשך הלילה. שטפו את הכתם ב-PBST ארבע פעמים, למשך 7 דקות כל אחת.
9. הכינו את תמיסת הנוגדנים המשנית הרלוונטית (IgG נגד עכבר עיזים בקנ"מ 1:5,000), ודגרו על הכתם במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף ב-PBST ארבע פעמים, למשך 7 דקות כל אחת.
10. לפתח את הכתם באמצעות ערכת chemiluminescence בהתאם להמלצות היצרן. מכסים את הכתם בניילון נצמד שקוף. לרכוש תמונות על ידי מערכת הדמיה chemiluminescence עבור chemiluminescence עם תוכנה רלוונטית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תא HCT 116	ATCC	CCL-247
צלחת 100 מ"מ	קורנינג	430161
MEM (EBSS)	היקלון	SH30024.01
סרום בקר עוברי (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C
נוגדן נגד טאו 13	אבקאם	dorit_19030
Dithiothreitol (DTT)	רוש	10 708 984 001	טמפרטורת אחסון: 2-8 °C
כורכומין	סיגמא-אולדריץ' (פלוקה)	78246	טמפרטורת אחסון: 2-8 °C
נוגדן נגד טאו (phospho S396)	ABCAM	ab109390
FastAP פוספטאז אלקליין רגיש לחום	תרמו סיינטיפיק	EF0651	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C
PMSF	סיגמא	P7626	יש לאחסן בטמפרטורת החדר
קוקטייל מעכב פוספטאז	איתות סלולרי	5870	יש לאחסן ב-4°C
קוקטייל מעכב פרוטאז	איתות סלולרי	5871	יש לאחסן ב-4°C
נוגדן משני IgG נגד עכבר עיזים	תרמופישר	A-11005	יש לאחסן ב-4°C בחושך
סודיום דודציל סולפט (SDS)	אפימטריקס	75819
Molecular Imager	ביו-ראד	ChemiDoc XRS+	יש לאחסן ב-4°C
חיץ RIPA	סיגמא	₪ 0278	טמפרטורת אחסון: 2-8 °C
טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ'	X - 100	יש לאחסן בסביבות 25°C
קרום PVDF	ביו-ראד	162-0177
נוגדן משני IgG נגד עכבר עיזים	תרמופישר	A-11005	יש לאחסן ב-4°C בחושך
סודיום דודציל סולפט (SDS)	אפימטריקס	75819
חלבון assay מגיב צבע	ביו-ראד	500-0006
סוניק דיסמברטור	פישר סיינטיפיק	דגם 500
מיקרוליטר צנטריפוגות	Hettich Zentrifugen	מיקרו 200 R