הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

13.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/2060

⸱

25 באוקטובר 2010

 , 
1Neurobiology and Anatomy, University of Rochester

במאמר זה

סיכום

בחומר וידאו משלים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור כרונית In vivo הדמיה של המוח שלם באמצעות הכנה דליל-הגולגולת.

תקציר

בשנת vivo הדמיה באמצעות שני פוטונים לייזר מיקרוסקופיית (2PLSM) מאפשר לימוד של תאים חיים תהליכים עצביים במוח שלם. הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה של אותו אזור של המוח במספר נקודות זמן (הדמיה כרונית) עם רזולוציה מיקרוסקופי המאפשר מעקב של הקוצים הדנדריטים שהם מבנים קטנים המייצגים את רוב אתרי מעוררים postsynaptic במערכת העצבים המרכזית. היכולת בבירור לפתור מבנים קורטיקליים קנס על מספר נקודות זמן יש יתרונות רבים, במיוחד במחקר של פלסטיות המוח שבו שינויים מורפולוגיים על הסינפסות שיפוץ מעגל עשוי לעזור להסביר את המנגנונים. בחומר וידאו משלימים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור כרונית in vivo הדמיה של המוח שלם באמצעות הכנה דליל-הגולגולת. ההכנה סחוט הגולגולת היא גישה פולשנית, אשר ימנע נזק אפשרי ואת הדורה / או קליפת המוח, ובכך להקטין את תחילתה של תגובה דלקתית. כאשר בפרוטוקול זה מבוצע כהלכה, אפשר בבירור לעקוב אחר השינויים המאפיינים עמוד השדרה הדנדריטים במוח שלם על פני תקופה ממושכת.

פרוטוקול

  1. כדי להמחיש את הנוירונים במוח שלם באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיה, הכנה שבו הנוירונים מסומנים עם סמנים ניאון משמש. בניסויים שהוצגו כאן אנו משתמשים בקו ה-GFP-M עכבר מהונדס אשר תוויות שכבה 5 תאים פירמידליים 1. 5 שכבת תאים פירמידליים פרויקט תהליכים דנדריטיים לשכבות שטחיות, המאפשר ויזואליזציה של דנדריטים הקוצים הדנדריטים עד לעומק של 300 מיקרומטר מתחת לרמה של פיא. גישה חלופית היא להשתמש בתאים התווית סמנים ויראלי (ראה Lowery et al. שהוגשה יופיטר).
  2. לחטא את סביבת העבודה באמצעות אתנול 70% כלים החיטוי לניתוח aseptic. כיסוי משטח הפעלה עם רוטב נקי.
  3. הרדימי עכברים עם קוקטייל פנטניל (פנטניל 0.05 מ"ג / ק"ג; midazolam 5 מ"ג / ק"ג; metatomadin 0.5 מ"ג / ק"ג) ואחריו מנה רבע Avertin (0.0075 מ"ג / מ"ל) באמצעות נהלים שאושרו IACUC. Pretreat עכברים עם משכך כאבים, עצירות (0.5 מ"ג / ק"ג) מנוהל תת עורית (SQ). צג את רמת מטוס הרדמה מהתגובה בדיקות לצבוט זנב / הבוהן.
  4. שמירה על בעלי חיים 37.5 ° C באמצעות שמיכה חימום עם מדחום רקטלי המצורפת.
  5. החל משחה עיניים אל העיניים כדי למנוע את העיניים מהתייבשות. הוד העיניים עם גיליון נייר קטנה כדי להגן על העיניים ממקור אור במהלך הניתוח.
  6. בעזרת מספריים, להסיר שיער מהחלק האחורי של הראש (מאחורי האוזניים) לעיניים.
  7. נקו את הראש של החיה עם יישום רציף של אתנול 70%, ואחריו לשפשף בבטאדין פתרון בבטאדין.
  8. בצע חתך L-לחתוך מאחורי האוזניים לאורך הצד או הימני או השמאלי של קו האמצע (תלוי באיזה חצי כדור תהיה הדמיה) לעיניים. מקפלים את העור מעל מהמקום הניתוח. אין להסיר עור כמו העור יהיה sutured בעקבות הפגישה הדמיה.
  9. בעזרת מלקחיים בסדר משוך בעדינות את העור כלפי מעלה והרחק מאזור העניין שלך.
  10. בעדינות לגרד ממנו את periosteum מאזור חשוף של הגולגולת עם מלקחיים נקי או להב microsurgical. בעזרת צמר גפן, מרחו כמות קטנה של כלוריד Ferric 10% הגולגולת לגמרי יבש הממברנה periosteum ולוודא כי הוא הוסר לחלוטין. חשוב הגולגולת יבש לחלוטין, כדי להבטיח שמירה נאותה של דבק (ראה 11). באמצעות מלקחיים או סכין microsurgical, בעדינות לגרד ממנו קרום periosteum יבשים.
  11. למרוח שכבה דקה של דבק cyanoacrylate סביב החלון הדמיה של צלחת ראש נירוסטה (ראה איור 1) ו להטביע את הצלחת לגולגולת.
  12. בעזרת קצה של מקל עץ כותנה מקלון, כדי להחיל דבק התפרים בתוך החלון הדמיה; לוודא למלא את כל הפערים בין הצלחת הדמיה העקמומיות של הגולגולת.
  13. מניחים טיפת דבק מאיץ לתוך החלון. במהירות למחות מאיץ דבק עודף עם מטלית כותנה או קים לנגב. הדבק צריך להיות מוצק לחלוטין לפני הקידוח.
  14. בגין דק את הגולגולת בחלון הדמיה באמצעות מקדח שיניים מודבקת עם 0.7 מ"מ נירוסטה בר. קידוח חלופית עם יישום מזדמנים של תמיסת מלח סטרילית 0.9%, כדי למנוע יצירת חום רב מדי על הגולגולת.
  15. חלון Thin 4x4 מ"מ בגולגולת באמצעות משיכות קטנות על פני השטח את הגולגולת עם המקדחה שיניים. בדוק את הרזון של הגולגולת עם מלקחיים סוף בוטה. פני הגולגולת תהיה הכניסה מעט עם לחץ עדין. עובי הגולגולת אופטימלי עבור הדמיה הוא בין 10 ל 30 מיקרומטר.
  16. כאשר הגולגולת הוא דק החלון לנקות את כל הפסולת, המקום מלוחים על הגולגולת. צילום חלון הדמיה עם מצלמה דיגיטלית רכוב על היקף הניתוחים. צילום ושימוש בכלי הדם במוח יסייעו באיתור המיקום למקום צלחת הדמיה עבור הפעלות הדמיה הבאים.
  17. התחבורה את בעל החיים מעטה 2-הפוטון. החיה צריכה להישאר על השמיכה חימום (עם בדיקה רקטלית) במהלך הפגישה הדמיה כולו. הערה: בעוד תחת סדציה, הגוף הליבה של החיה טמפרטורה ינוע מאוד בהעדר יחידת החימום וכתוצאה מכך פגיעה בקליפת המוח או אולי מוות.
  18. מיקרוסקופ שני הפוטונים עם המאי טאי לייזר, משאבה 10W מצב מוצק כוח מקסימלית אולימפוס שונה יחידת Fluoview confocal משמש. המערכת מותאמת במיוחד עבור הדמיה רקמות עמוק גלאי חיצוני מותקנים קרוב אובייקטיבי ככל האפשר, כדי לאפשר גילוי מרבי של הקרינה מהמוח. LUMPlan Olympus FL / IR עדשה 20X/0.95NA אובייקטיבי משמש. מלח 0.9% משמש במהלך הדמיה עבור הטבילה אובייקטיבי.
  19. שימוש במיקרוסקופ, עם זום דיגיטלי נמוכה (x1) לזהות אזור המכיל נוירונים שכותרתו במאור פנים.
  20. שימוש במצלמה דיגיטלית מודבקת פיסת עין המיקרוסקופ, לצלם באזור הדמיה. לחלופין, לשרטט את התבנית vasculature דם. זה הכרחי מחדשלהפוך את המיקום הדמיה אותו בנקודת הזמן שלאחר מכן.
  21. השג ערימה הגדלה נמוכה (X20 אובייקטיבי, 512x512 פיקסל; 5 צעד מיקרומטר) באמצעות במידה לעין כל של המוח (בדרך כלל פורש ~ 200 מיקרומטר) מראה את מידת הסתעפות דנדריטים. הערה: את התמונה בהגדלה נמוכה ישמש כדי לאתר את האזור הדמיה בנקודות זמן עוקבות כמו גם כלי הדם דנדריטים לשמור על המבנה שלהם בבעלי חיים צעירים למבוגרים.
  22. באמצעות תוכנת הדמיה (Fluoview, נ '5.0, FV300), להגדיל הגדלה דיגיטלית 8 פי. התאם את X, Y קואורדינטות (מחבת הקואורדינטות) אם יש צורך לאסוף ערימה בהגדלה גדולה אשר יראה מורפולוגיה הדנדריטים מפורט כולל את מיקומי ואת המבנה של הקוצים הדנדריטים. הערות מפורטות לגבי כל אוסף ערימה, כלומר מחבת קואורדינטות, טווח של איסוף, גודל Z-צעד את מספר הצעדים בערימה שלך. הערות אלה ישמשו כאשר חוזרים דנדריט זה או האקסון בנקודת הזמן שלאחר מכן.
  23. בעקבות הדמיה, הסר את צלחת הראש בעדינות על ידי הפרדת צלחת מפני השטח הגולגולת. בעזרת מלקחיים, להסיר את כל שאריות הדבק שנותרו על הגולגולת לנגב משטח הגולגולת עם תמיסת מלח סטרילית 0.9%. לתפור את העור מעל הגולגולת יחד באמצעות # 6 חוט התפירה. אזור נגב עם 70% אתנול. כדי להקל על הכאב במהלך ההתאוששות שלאחר הניתוח, לנהל 0.1 מ"ג / ק"ג כאבים עצירות, SQ.
  24. מקום חיות בכלוב נקי מתחת לפנס חום עד מתעורר הוא נייד. חזור החיה לכלוב המקורי.
  25. כדי החי Reimage בשלב מאוחר יותר (זמן שלנו הדמיה נקודות יכול להיות בכל מקום בין 2 ימים חודשים רבים בנפרד), להסיר את התפרים או לפתוח מחדש את העור על הראש באמצעות שיטות aseptic לעיל. השתמש תמונה דיגיטלית של המוח vasculature (שצולמו במועד הניתוח הראשון) כדי לאתר את המיקום הדמיה המקורי. Reaffix נירוסטה headplate (שלבים 10-12). השתמש להב microsurgical בעדינות דקה משם כל עצם שאולי מחדש גדל בין נקודות הדמיה הזמן. אם יש צורך, דק עם מקדח שיניים. הדמיה חלון שקוף של פסולת וליישם ירידה של 0.9% סליין סטרילית.
  26. Carry החיה מיקרוסקופ שני הפוטונים ולאתר בתחום ההדמיה המקורית. השתמש בצילום דיגיטלי נלקח במהלך הפגישה הדמיה הראשון סיוע.
  27. פתח את התוכנית Fluoview ולפתוח את התמונה המקורית בהגדלה נמוכה. לצרף גיליון שקיפות למסך המחשב לשרטט את כלי הדם הגדולים דפוס באמצעות עט שקיפות.
  28. פתח את התמונה חיה ויישר מחדש את הדם בכלי הדם לדפוס שירטט על הסרט שקיפות.
  29. כדי Reimage 8x zoomed במבנים, לפתוח את מחסנית שנאספו הרצוי מההפעלה הדמיה הקודם. סקיצה המבנה (axonal כלומר, דנדריטים, גליה) על סרט שקיפות, מודבקת על מסך המחשב.
  30. קרב 8x מהתמונה חי ולהגדיר את המחבת קואורדינטות הפרמטרים הדמיה היום הראשון. בהתאם דיוק של יישור מיקום הגדלה נמוך, ייתכן שיהיה צורך גם לשנות את הזווית של התמונה במקצת. לאחר המבנה המבוקש נמצא, להתאים את המבנה לדפוס שירטט שלך בהגדלה גבוהה. אסוף את Z-מחסנית עם גודל צעד מספר זהה של Z-מחסנית תמונות לניתוח שלאחר מכן.
  31. חזור על שלבים 29 ו - 30 עד שכל התמונות בהגדלה גבוהה מחדש שנאספו.
  32. כאשר ההדמיה תושלם, חזור על שלבים 22-24. Re-הדמיה ניתן לחזור במהירות של עד 2 נקודות זמן נפרדות.
  33. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי ביבר אגף לרפואה של בעלי חיים המעבדה של אוניברסיטת רוצ'סטר בית הספר לרפואה ורפואת שיניים, ב ההסמכה מלא על ידי האגודה הערכה וההסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה, הבינלאומי (AAALAC) ונמצאים ציות לחוק המדינה, החוק הפדרלי מדיניות NIH.

נציג תוצאות

ב-GFP-M עכברים להביע, קבוצת משנה של שכבה 5 תאים דנדריטים פירמידה ותהליכים המתאימים יכול בקלות להיות דמיינו באמצעות 2-פוטון סריקת לייזר מיקרוסקופית (2PLSM) 1. כאן אנו הפגינו הכנה דליל-הגולגולת שבו הגולגולת מעל המיקום הרצוי הדמיה מדולל ל ~ 10-30 מיקרומטר. בביצוע נכון, פרוטוקול שלנו אפשרה לנו בבירור לדמיין דנדריטים קליפת המוח ועמוד השדרה בקליפת המוח הראייתית שלם לניתוח אקוטית או כרונית (איור 2).

איור 1
באיור 1. ראש מותאם אישית צלחת הבסיס. (א) להציג לראש בראש בהתאמה אישית ועל צלחת הבסיס המשמשים להכנת דליל, ניתוח בגולגולת. (ב) להציג צד של הראש מחוייט צלחת הבסיס. (C, D) סכמטי מפורט תמונה של צלחת ראש.

איור 2
in vivo בקליפת המוח הראייתית של עכבר ה-GFP-M מהונדס באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ. התמונה היא הקרנה של תמונה אחת להשיג כל 5 מיקרומטר מן פיא לעומק סופי של 175 מיקרומטר. אזור ארוזות מייצג את האזור מוגדל ב (ב) ו - (ג) צילמו ביום 0 (D0) וארבעה ימים מאוחר יותר (D4). (D, E) הגדלה גבוהה של הסניף הדנדריטים ארוזות B ו-C הוכחת שדרה יציב (ראשי חץ לבן), איבד / קוצים retracting (ראשי חץ אדום) ואת עמוד השדרה החדש (ראשי חץ ירוק). ברים סולם = א 200 מיקרומטר, B, C. 20 מיקרומטר, D, E. 5 מיקרומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הדמיה כרונית באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיה הופכת פופולרית יותר ויותר טכניקה ללמוד שינויים מורפולוגיים מופעלות במהלך 2-5 הפלסטיות. כאן אנו מדגימים הכנה דליל, גולגולת לעקוב הקוצים הדנדריטים מזוהה במוח העכבר על ימים שלמים הדמיה שונים. בפרוטוקול זה, הגולגולת נותר בשלמותו, גרימת נזק מינימלי לקליפת המוח וכתוצאה מכך רמות נמוכות מאוד של neuroinflammation אשר עשוי לשנות את תפקוד המוח 6. זה מאפשר את החיה להיות צילמו מיד לאחר הניתוח הראשון ולאחר מכן reimaged ימים לאחר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרס Wellcome קריירה בורוז במדעי ביו (AKM), קרן וייטהול מענק מחקר (AKM), מלגת קרן סלואן (AKM), NIH EY019277 (AKM), וכן במימון ניי, חזון הדרכה גרנט, EY013319 ( EAK).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פנטניל ציטראטבתוך המוסדתערובת פנטניל: תערובת חומרי הרדמה;
מינון IP: 0.0125 מ"ל/גרם

ריכוז תמיסת קוקטייל סופית: 0.05 mg/kg
מדעטומידין הידרוכלורידבתוך המוסד (In House)תערובת פנטניל: תערובת חומרי הרדמה;<דימות in vivo באמצעות מיקרוסקופיית סריקה בלייזר דו-פוטונית (2PLSM) מאפשר את חקירת תאים חיים ותהליכים עצביים במוח השלם. הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת דימות של אותו אזור במוח במספר נקודות זמן (דימות כרוני) ברזולוציה מיקרוסקופית המאפשרת מעקב אחר קוצים דנדריטיים, שהם המבנים הקטנים המהווים את מרבית האתרים הפוסט-סינפטיים המעוררים במערכת העצבים המרכזית (CNS). היכולת להבחין בבירור במבנים קורטיקליים עדינים לאורך מספר נקודות זמן בעלת יתרונות רבים, ובמיוחד בחקר פלסטיות מוחית, שבה שינויים מורפולוגיים בסינפסות ועיצוב מחדש של מעגלים עשויים לסייע בהסבר המנגנונים העומדים בבסיסן. בסרטון זה ובחומרים הנלווים, אנו מציגים פרוטוקול לדימות כרוני in vivo של המוח השלם באמצעות הכנה של גולגולת מודקת (thinned-skull preparation). הכנה של גולגולת מודקת היא גישה זעיר-פולשנית, המונעת נזק פוטנציאלי לקרום העבה (dura) ו/או לקורטקס, ובכך מפחיתה את התפתחות התגובה הדלקתית. כאשר פרוטוקול זה מבוצע נכון, ניתן לנטר בבירור שינויים במאפייני הקוצים הדנדריטיים במוח השלם לאורך תקופה ממושכת.>מינון IP: 0.0125 מ"ל/ג'<דימות במודל חי (in vivo) באמצעות מיקרוסקופיה של סריקת לייזר דו-פוטונית (2PLSM) מאפשרת את חקר התאים החיים והתהליכים העצביים במוח שלם. הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת דימות של אותו אזור במוח במספר נקודות זמן (דימות כרוני) ברזולוציה מיקרוסקופית, המאפשרת מעקב אחר קוצים דנדריטיים, שהם המבנים הקטנים המהווים את מרבית האתרים העשירים פוסט-סינפטיים במערכת העצבים המרכזית (CNS). ליכולת להבחין בבירור במבנים קורטיקליים עדינים לאורך מספר נקודות זמן ישנם יתרונות רבים, במיוחד בחקר הפלסטיות של המה, שבו שינויים מורפולוגיים בסינפסות ועיצוב מחדש של מעגלים עשויים לסייע בהסברת המנגנונים העומדים בבסיסם. בסרטון זה ובחומרים הנלווים, אנו מציגים פרוטוקול לדימות כרוני במודל חי של מוח שלם באמצעות הכנה של גולגולת מודקה (thinned-skull). הכנת גולגולת מודקה היא גישה עם פולשנות מינימלית, המונעת נזק פוטנציאלי לדורה (קרומי הגולגולת) ו/או לקורטקס, ובכך מפחיתה את התפתחות התגובה הדלקתית. כאשר פרוטוקול זה מבוצע כהלכה, ניתן לנטר בבירור שינויים במאפייני הקוצים הדנדריטיים במוח שלם לאורך תקופה ממושכת.>
ריכוז סופי של תערובת: 0.05 mg/kg
מידזולאם HClבתוך המבנהתמיסת פנטניל: תמיסת הרדמה;
מינון IP: 0.0125 מ"ל/ג'

ריכוז תמיסת קוקטייל סופית: 0.05 mg/kg
2,2,2-טריברומו–אתנול תערובת אברטין (Avertin Cocktail): חומר הרדמה;
מינון IP: 0.0075 סמ"ק/גרם

ריכוז תמיסת קוקטייל סופית: 1%
2-methyl-2-butanol (ריכוז סופי: 0.775%)תערובת אברטין (Avertin Cocktail): חומר הרדמה;
מינון IP: 0.0075 cc/g

ריכוז תמיסה סופית: .775%
מערכת בקרת טמפרטורה TC-1000 לעכברים.CWE, Incעכבר TC-1000ויסות טמפרטורת הגוף
Toberadexבמעבדהמשחה לעיניים
10% Ferric ChlorideRicca Chemical Company3120-32הכנה של גולגולת דקה
להב מיקרו-כירורגיSable IndustriesS-6400הכנת גולגולת מדוקקת
Cyanoacrylate 404,401Loctiteמק"ט 46551הכנת גולגולת מודקה
Cyanoacrylate 401Loctiteמק"ט 40140הכנת גולגולת דקה
מאיץ דבק Zip Kickerטכנולוגיית PacerPT-29הכנה של גולגולת מדללת
מקדחים זעירים מפלדה, קוטר ראש 0.7 מ"מFine Science Tools19008-07הכנת גולגולת מודקה
תיבת בקרה של מיקרו-מומנט ויחידת יד Tech2000Ram Products, Inc.TECH2000ON/OFFהכנת גולגולת מדוקקת
תפר משי מס' 6-0 (0.7 מטרי)Ethicon Inc.K8894Hקונוס C-1
פינצטה לחבישת עיניים, 10 ס"מ, רוחב קצה 0.5 מ"מ, מעוקלתכלים כירורגייםFine Science Tools11152-10
מספרי Bonn עדינים במיוחד, 8.5 ס"מ, קצה ישר, קצה חיתוך 13 מ"מכלים כירורגייםFine Science Tools14084-08
פינצטה סטנדרטית לדגימה, ישרה, קצה 2.5 מ"מx1.35 מ"מ, 12 ס"מכלי ניתוחFine Science Tools11000-12

מקורות

  1. Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  2. Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  3. Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo. J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).
  4. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
  5. Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  6. Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דימוי דו-פוטונידימוי של קוצים דנדריטייםדימוי מוחי כרונינוירונים מסומני GFPמורפולוגיה של קוצים דנדריטייםמחקר על פלסטיקה קורטיקליתמיקרוסקופיה אין-ויוו (In Vivo)פרוטוקול לדילול הגולגולת
הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.