פרוטוקול זה מנצל לנתץ assay כדי לקבוע את רמות של GTPase RhoC פעיל בתוך התאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
RhoC GTPase יש הומולוגיה 91% ל RhoA GTPase. בגלל השכיחות שלה בתאים, ריאגנטים רבים וטכניקות RhoA GTPase פותחו. עם זאת, RhoC GTPase מתבטא תאים סרטניים עם גרורות ברמות נמוכות יחסית. לכן, כמה RhoC ספציפי ריאגנטים פותחו. יש לנו להתאים assay ההפעלה Rho GTPase כדי לזהות RhoC. טכניקה זו משתמשת GST-Rho תחום מחייב היתוך חלבון לשלוף פעיל GTPase RhoC. בנוסף, אנחנו יכולים לקצור חלבון הכולל בתחילת assay כדי לקבוע רמות בסך הכל (GTP והתוצר כבול) GTPase RhoC. זה מאפשר להגדרה של GTPase RhoC פעיל לעומת סך בתא. כמה גירסאות מסחריות של הליך זה פותחו עם זאת, ערכות המסחרי מותאמים RhoA GTPase ובדרך כלל אינם פועלים היטב עבור RhoC GTPase. חלקים של assay שונו, כמו גם פיתוח של נוגדנים RhoC ספציפי.
פרוטוקול
1. הכן GST-Fusion חלבון
- מניות של גליצרול JM109 המכיל חיידקים המוסמכת הראשונה N-מסוף 90 חומצות אמינו של Rho rhotekin מחייב מושלם (RBD) subcloned לתוך pGEX3x BamH1/EcoR1 וקטור נעשים.
על מנת להבטיח יעילות גבוהה השלבים הבאים יש לבצע עבור כל ניסוי. מניסיוננו, המוכן טרי GST-RBD היא המפתח assay חזקים ומדויקים ההפעלה GTPase. - הוסף 50 μL (בקירוב, לא להפשיר) של מניות גליצרול כדי מ"ל של 50 אמפר LB ולגדול 37 ° C במשך הלילה עם רעד.
- מדולל ב 01:10....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השלב הקריטי ביותר של ההליך הוא דור של טרי GST-RBD. אי לשים לב בשלב זה היא הסיבה העיקרית לכישלון. כל המדרגות, מדור של GST-RBD (1.2) כדי הדגירה לילה עם lysate התא (2.5), צריך להיעשות ביום אחד. צעד נוסף הוא חיוני כדי לוודא שיש מספיק תאים כדי להפיק את lysates התא. זו היא בעלת חשיבות מיוחדת כאשר מסתכלים RhoC GTPase, שנוטה להיות נוכח רמות נמוכות בתא.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
מחלקת הביטחון W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 ו W81XWH-08-1-0356
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חרוזי Gluthione-sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| ג'לים של Criterion 4-20% Tris-HCl | Bio-Rad | 345-0032 |
מקורות
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
