אנו להדגים פרוטוקול לבידוד axoplasm מתוך עצב השת עכברוש מבוגר מבוסס על דיסקציה של fascicles עצב הדגירה במדיום hypotonic לשחרר המיאלין ואת lyse הלא axonal מבנים, ואחריו מיצוי של החומר האקסון מועשר הנותרים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
בידוד של הציטופלסמה axonal טהור (axoplasm) מתוך עצב היקפי הוא קריטי עבור מחקרים ביוכימיים של תהליכים ביולוגיים רבים. במאמר זה, אנחנו מדגימים ולתאר פרוטוקול לבידוד axoplasm מתוך עצב השת עכברוש מבוגרים המבוססת על הצעדים הבאים: (1) דיסקציה של fascicles עצב והפרדה של רקמות החיבור, (2) הדגירה של קטעים קצרים של fascicles העצב בינוני hypotonic לשחרר את המיאלין ואת lyse הלא axonal מבנים; ו (3) מיצוי של החומר האקסון מועשר הנותרים. אפיון proteomic וביוכימיות של הכנה זו אישרה רמה גבוהה של העשרת עבור רכיבים axonal.
פרוטוקול
פרוטוקול זה מאפשר בידוד axoplasm עם צמצום של זיהום גליה רקמות וכלי דם. השיטה מניבה כ 70-100 axoplasm סך מיקרוגרם חלבון לכל one 8-10 חולדה הישנה שבוע Wistar.
1. לנתח עצבים sciatic
- להרדים שני עכברושים משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. אשר למוות על ידי מישוש מחוסר דופק לפני תחילת לנתיחה.
- ספוגית באזור דיסקציה עם אתנול 70%.
- חותכים את העור, השרירים להפריד ולבודד עצב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מנתח ביוכימיים ו proteomic אישרו כי הליך זה מפחית את זיהום תא בסרום גליה 3 לעומת השיטות שתוארו בעבר על ידי בידוד axoplasm לסחוט מכני 1. השתמשנו בפרוטוקול זה בידוד axoplasm לחקור dynein מבוססי איתות מדרדר לאחר פגיעה עצבית sciatic 2, מצפה שיהיה השירות בחקר של תהליכים רבים אחרים העצבים ההיקפית מבוגר, לרבות האקסון, גליה אינטראקציות 4.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
חומרים
- זכר Wistar חולדות (80-10 שבועות)
- PBS 0.2X ו pbs 1X פתרונות המכילים מעכבי פרוטאז (Roshe) 2 טבליות לכל 50 מ"ל
- Eppendorfs עבור 1.5 מ"ל
- לעקר כלי פלסטיק 35 מ"מ
- כלים לנתח כולל: מספריים מלקחיים קנס
- המשקפת שולחן אור
נוגדנים
עכבר אנטי GFAP שיבוט GA-5 היה מן סיגמא (G6171). הארנב נגד אלבומין היה מן Cedarlane (CLAG5140). אנטי טובולין עכבר β3 ו הארנב נגד gERK היו סיגמא (T2200 ו - M5670 בהתאמה).
מקורות
- Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve. Neuron. 40, 1095-1104 (2003).
- Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
