Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

סיכום

הפעילות של decarboxylase ועין מתנהלת ליזין מנוטר על ידי מגיבים המצע L-ליזין לבין המוצר קדברין עם חומצה 2,4,6 trinitrobenzensulfonic-לטופס adducts כי יש מסיסות ההפרש ב טולואן.

תקציר

Escherichia coli הוא חיידק enteric כי הוא מסוגל לגדול על פני טווח רחב של ערכי ה-pH (pH 5-9) ^1, לא ייאמן, הוא מסוגל לשרוד חומצה קיצונית מדגיש כולל מעבר דרך הקיבה יונקים שבו pH יכול ליפול נמוך כמו pH ^פבואר 01-02. כדי לאפשר כזה מגוון רחב של הישרדות pH חומצי, א coli בעלת ארבעה שונה ועין מתנהלת חומצה אמינית decarboxylases כי המצע שלהם decarboxylate חומצות אמינו בצורה פרוטון תלויי ובכך להעלות את ה-pH הפנימי. Decarboxylases כוללים חומצה גלוטמית decarboxylases GadA ו GadB ^3, decarboxylase ארגינין עדיה ^4, decarboxylase ליזין LdcI ^{5, 6} ו decarboxylase ornithine SpeF ^7. כל אנזימים אלה לנצל pyridoxal-5'-phospate כגורם משותף ⁸ ולתפקד יחד עם המצע מוצר antiporters-הקרום הפנימי להסיר מוצרים decarboxylation למדיום חיצוני תמורת מצע טרי ^2. במקרה של LdcI, antiporter ליזין-קדברין נקרא CadB. לאחרונה, אנו נקבע את מבנה רנטגן של גביש LdcI ל 2.0, ואנו גילו מולקולה קטנה, רומן חייב LdcI התגובה מחמירים הרגולטור guanosine 5'-diphosphate, diphosphate 3'-(ppGpp) ^14. התגובה מחמירים מתרחשת כאשר התאים גדל באופן אקספוננציאלי ניסיון חסך תזונתי או אחת למספר מדגיש אחרים ^9. כתוצאה מכך, התאים לייצר ppGpp שמוביל מפל איתות ששיאה במעבר גידול מעריכי לגידול שלב נייח ^10. אנחנו הוכיחו כי ppGpp הוא מעכב ספציפי של LdcI ^14. כאן אנו מתארים את assay decarboxylase ליזין, שונה מן assay שפותחה על ידי Phan et al. ^11, שיש לנו כדי לקבוע את הפעילות של LdcI והשפעת pppGpp / ppGpp על פעילות זו. התגובה decarboxylation LdcI מסיר את קבוצת α-carboxy של L-ליזין מייצרת פחמן דו חמצני קדברין polyamine (1,5-diaminopentane) ^5. L-ליזין קדברין ניתן הגיבו 2,4,6-trinitrobenzensulfonic חומצה (TNBS) ב-pH גבוה כדי לייצר N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-קדברין) ו-N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-ליזין), בהתאמה ^11. TNP-קדברין ניתן להפריד TNP-ליזין כמו לשעבר הוא מסיס בממסים אורגניים כגון טולואן בזמן האחרון הוא לא (ראו תרשים 1). טווח ליניארי של assay נקבע באופן אמפירי באמצעות מטוהרים קדברין.

פרוטוקול

1) ריאגנטים וציוד

1. ראשית, להכין את הדברים הבאים שלושה פתרונות: 1 מ"ל של פתרון אשר מורכב של 8 מ"מ L-ליזין, נתרן 100 mM 2 - (N-Morpholino) ethanesulphonic חומצה (MES) pH 6.5, 0.2 מ"מ נוקלאוטיד, שם הוא נוקלאוטיד או: diphosphate guanosine (תמ"ג), guanosine טריפוספט (GTP), guanosine 5'-diphosphate, diphosphate 3'-(ppGpp), או guanosine 5'-טריפוספט, diphosphate 3'-(pppGpp), 0.1 מ"מ pyridoxal 5'-פוספט (PLP), ו - 1 mM β-mercaptoethanol / (β-ME). 1 מ"ל של B פתרון המורכב נתרן 100 mM MES-pH 6.5, 0.1 מ"מ PLP, 1 mM β-ME, ו - 50 ננומטר LdcI. LdcI היה מטו....

דיון

ב assay decarboxylase ליזין, TNBS הוא הגיב עם אמינים העיקרי של L-ליזין קדברין כדי ליצור TNP-ליזין TNP-קדברין adducts (איור 1). בשל נוכחותם של הקבוצה חומצה carboxylic על TNP-ליזין, adduct זה נשאר מסיסים במים בעוד TNP-קדברין, חסרה הקבוצה חומצה carboxylic, הוא מסוגל מחיצות לתוך טולואן ^11. סוג זה של assay יכול להיות מנוצל באופן נרחב יותר על סוגים אחרים של חומצות האמינו שבו הפסד של קבוצת חומצה carboxylic מתרחשת במהלך התגובה. זו מתרחשת במהלך decarboxylation של ornithine-L על .......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid	Sigma-Aldrich	P2297
0.1 mM pyridoxal 5’-phosphate (PLP)	Sigma-Aldrich	P9255
Cadaverine	Sigma-Aldrich	D22606
לוחיות פוליסטירן בעלות 96 בארות	Sarstedt Ltd
לוחית קוורץ בעלת 96 בארות	Hellma
בלוק חימום דיגיטלי VWR	VWR international
ThermoStat Plus	Eppendorf
לוחיות פוליפרופילן בעלות 96 בארות, 2.0 mL	Axygen Scientific	P-DW-20-C
פיפטור חוזר Handy Step	Brand GmbH
טיפים לפיפטור חוזר, 12.5 mL	Brand GmbH	702378
קורא לוחות SpectraMax 340PC	SpectraMax