הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

סיכום

פיתחנו פרוטוקול פשוט לגשת לשחזור בתגובה הפיוניות לחיידקים לחיות. שיטה זו מקטינה ופצע ומניפולציה של העלה, לעומת השימוש קליפות אפידרמיס שדווח קודם לכן.

תקציר

הפיוניות הם פתחים טבעיים האפידרמיס המפעל אחראי חילוף הגזים בין הצמח הפנים ואיכות הסביבה. הם נוצרו על ידי זוג של תאים השומר, אשר מסוגלים לסגור את הנקבוביות הפיוניות בתגובה למספר גורמים חיצוניים כולל עוצמת האור, ריכוז דו תחמוצת הפחמן, והלחות היחסית (RH). נקבוביות הפיוניות הוא גם הנתיב העיקרי לכניסה הפתוגן לתוך העלים, צעד חיוני להתפתחות המחלה. מחקרים שנעשו לאחרונה חשפה כי סגירת נקבוביות יעיל לצמצום התפתחות מחלה חיידקית בצמחים ארבידופסיס; חלק אינטגרלי של חסינות מולדת צמח. בעבר, השתמשנו קליפות אפידרמיס כדי להעריך את התגובה הפיוניות לחיות חיידקים (Melotto et al 2006.), אולם שמירה על תנאים סביבתיים נוחים עבור שתי קליפות צמח אפידרמיס ותאי חיידקים כבר מאתגר. האפידרמיס ליף יכולים להישמר חי ובריא עם MES חיץ (10 mM KCl, 25 מ"מ MES-KOH, pH 6.15) עבור ניסויים של תאים אלקטרו השומר. עם זאת, החיץ הזה אינו מתאים לקבלת ההשעיה חיידקי. מצד שני, תאים חיידקיים יכולים להישמר חי במים וזה לא תקין כדי לשמור על קליפות אפידרמיס לתקופה ארוכה של פעמים. כאשר צף על פני המים לקלף אפידרמיס, התאים לקלף, כי הם חשופים אוויר יבש בתוך 4 שעות להגביל את העיתוי לבצע את הניסוי. השיטה האידיאלית להעריך את ההשפעה של גירוי מסוים על תאים השומר צריך להציג התערבות מינימלית הפיזיולוגיה הפיוניות ועל הסביבה הטבעית של הצמח כמה שיותר. אנו, אפוא, פיתחו שיטה חדשה כדי להעריך את התגובה הפיוניות לחיות חיידקים אשר ופצע עלה מניפולציה ממוזער באופן משמעותי במטרה לספק assay הפיוניות לשחזור בקלות ואמין. פרוטוקול מבוסס על מכתים עלה שלם עם יודיד propidium (PI), הדגירה של מכתים עלה עם ההשעיה חיידקי, והתבוננות עלים תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal. לבסוף, שיטה זו מאפשרת תצפית המדגם העלה אותו לחיות על פרקי זמן ארוכים באמצעות תנאים מקרוב לחקות את התנאים הטבעיים שבהם צמחים מותקפים על ידי פתוגנים.

פרוטוקול

1. צמחים וחיידקים הכנת

1. כדי להתחיל בהליך זה לזרוע זרעים ארבידופסיס על v 01:01:01: v: v תערובת של גידול בינוני (Redi הארץ תקע ומערבבים שתיל, סאן Gro), vermiculite בסדר, perlite.
2. לגדל את הצמחים בתא הגידול (22 ° C, 12 שעות של אור μmol / mm ² / sec 100 יום ו 65 ± 5% לחות) ומים לפי הצורך. הצמחים מוכנים לשימוש בתוך 4-6 שבועות, כאשר יש להם עלים צעירים הרחיב באופן מלא לקראת נעילה.
3. יומיים לפני תחילת הניסוי להכין את התרבות החיידק. Streak Pseudomonas syringae ממלאי גליצרול על מדיום LB שונה (10 g / L tryptone, 5 g / L תמצית שמרים, 5 g / L NaCl pH 7.0, ו - אגר 1.5%) ו דגירה של 24 שעות 28 ° C. השתמש תרבות טרי להכין את inoculum ותמיד להתחיל צלחות תרבות ממניות גליצרול כמו חיידקים הופכים אלימים פחות משנה לאחר culturing.
4. השתמש חיידקים שגדלו על הצלחת להתחיל תרבות של 10 מ"ל נוזל פ syringae בתוך בקבוקון 50 מ"ל Erlenmeyer. דגירה התרבות לילה בשעה 28 ° C עם נמרצת רועד עד שהוא מגיע או צפיפות אופטית OD ב 600 ננומטר בין 0.8 ו 1.
5. מדוד את OD ב 600 ו לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 1360 במשך 10 דקות. Resuspend התאים במים מזוקקים כך OD 0.2 הסופי. OD זו תואמת את 10 ⁸ יחידות המושבה להרכיב (CFU) / mL. עם חיידקים מוכן להמשיך להכין את העלים לבצע את assay.

2. ליף מכתים ו דגירה עם חיידקים

1. על מנת כתם עלים הראשון להכין 20 מיקרומטר propidium יודיד או פתרון לצרכן במים. 10 מ"ל של תמיסת מספיק כתם 3 עלים קטנים בכל פעם.
2. אחזר את הצמחים מן החדר צמיחה עם מלקחיים לנתק 3 צעיר, מלא מורחבת עלים. לטבול את העלים שלמים פתרון לצרכן במשך 5 דקות. ואז להסיר את העלים ולשטוף אותם בקצרה עם מים מזוקקים.
3. המקום הבא עלה עם המשטח התחתון פונה כלפי מטה על שקופיות מיקרוסקופ. חותכים את העלים בסכין גילוח חד לארבעה חלקים למעט וריד באמצע כך העלה מניח שטוח בשקופית.
4. כדי לדגור את החיידקים עם העלים, להוסיף 300 μL ההשעיה חיידקי תחת חתיכות עלה בשקופית. וודא כי פני השטח התחתון של העלה נמצא בקשר עם inoculum.
5. דגירה הדגימות בתנאים סביבתיים אותו ששימשו לגידול צמחים. באותו זמן להתבונן עלים מתחת למיקרוסקופ, להעביר את פיסות עלים לשקופית חדשה עם המשטח התחתון פונה כלפי מעלה. שים לב לא להחליק לכסות משמש כאשר גובר על השקופיות. המדגם העלה אותו ניתן הדמיה מספר פעמים במהלך הדגירה וקורס זמן ניתן להגדיר על פי מטרות המחקר.

3. , מיקרוסקופית מדידה ניתוח נתונים

1. הנה לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal (Meta LSM 510, Carl Zeiss Inc) משמש כדי לבחון את העלים. שים את פני השטח התחתון של העלים כדי לזהות את הקרינה של PI (עירור 453 ננומטר, פליטת 543 ו - 620 ננומטר).
2. באמצעות דגימות עלים אותו לצלם תמונות של הפיוניות לאורך זמן. שמור את התמונות למדידת רוחב הפתח הפיוניות.
3. מדידת רוחב הצמצם הפיוניות של הפיוניות לפחות 60 עבור כל טיפול בכל נקודת זמן באמצעות תמונה דפדפן LSM.
4. חשב את השגיאה הממוצעת ורמת עבור רוחב הצמצם הפיוניות. משמעות סטטיסטיים של התוצאות יכול להיות מחושב באמצעות 2 זנב, סטודנט חכם לזווג של t-test.

4. תמונות נציג תגובת הפיוניות כדי דגירה עם חיידקים

1. הנה תמונה מיקרוסקופיים טיפוסיים (באמצעות המטרה 20x) של פני השטח עלה ארבידופסיס תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal בתצוגה בשדה בהיר (איור 1).
2. Propidium כתמים יודיד את דופן התא של תאים קיימא להגדיל את הנראות של התאים השומר בנוסף המאפשר זיהוי של תאים פגומים לאיסוף נתונים (איור 2). מגוון של פתחי הנקבוביות הפיוניות ניתן לראות micrographs אלה, מן הפיוניות סגורות לחלוטין הפיוניות לרווחה.
3. הפיוניות סגורות לגמרי מזוהים על ידי הצורה של התאים השומר (איור 3). רוחב הפתח נחשבת 0 מיקרומטר.
4. עבור הפיוניות פתוחות (איור 4) רוחב הצמצם הראו נמדדת באמצעות קו ישר נמשך על פני שטח רחב של הנקבובית הפיוניות.
5. אלו הן תוצאות הניסוי אופייני assay זה הפיוניות. עלים Arabidopis הודגרו בחושך עם שלושה זנים שונים של Pseudomonas syringae. רק החיידק היה Pst DC3000 מסוגל לפתוח כהה הפיוניות סגורות, כפי שנמדד על ידי רוחב הצמצם של הפיוניות 60 שנבחרו באקראי לכל זן חיידקי (איור 5).


באיור 1. מיקרוסקופ של פני השטח של עלה של ארבידופסיס. אחת שדה הראייה של השטח עלה תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal (LSCM) באמצעות המטרה 20x. שים לב הצמצם הפיוניות אינו ברור כאשר לעומת להציג את פלורסנט שנעזר מכתים יודיד propidium (איור 2).


איור 2. מיקרוסקופ של פני השטח של עלה יודיד מוכתם propidium ארבידופסיס. אחת שדה הראייה של השטח עלה תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal (LSCM) באמצעות המטרה 20x. הערה מגוון של פתיחת הנקבוביות הפיוניות. החצים צהוב הצביע לחלוטין קרוב הפיוניות וחצים ירוקים הם הצביעו על הפיוניות לרווחה.


איור 3. לגמרי הפיוניות קרוב שזוהו על ידי צורת ופתיחת בין התאים השומר. רוחב הצמצם נחשב 0 מיקרומטר.


איור 4. הפיוניות פתח המציגה את רוחב הצמצם ב מיקרומטר. המדידות נלקחו באמצעות הדפדפן LSCM מבוסס על קו ישר נמשך על פני שטח רחב של הנקבובית הפיוניות.


איור 5. הצמצם הפיוניות של עלים ארבידופסיס מודגרות עם שלושה זנים של עגבניות Pseudomonas syringae pv:.. DC3118, DB29, ו DC3000 צמחים הוחזקו בחושך בזמן ניסויים. התוצאות מוצגות כממוצע (n = 50-70) ± שגיאת התקן. משמעות סטטיסטיים זוהה עם מבחן t-שני זנב של הסטודנטים. הניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים עם תוצאות דומות.

דיון

הצגנו הליך ישר קדימה כדי למדוד את הצמצם הפיוניות ברקמה עלה שלם המאפשר הערכה קלה של הפיוניות תגובה לטיפולים שונים.

למרות הצגנו תוצאות השימוש במערכת מודל ארבידופסיס / Pseudomonas syringae, assay עלה שלם הפיוניות יכול להתבצע באופן פוטנציאלי עם שילוב צמחים חיידק כלשהו. הפרוטוקול יכול בקלות להיות שונה כדי להתאים לדרישות צמיחה של צמחים אחרים חיידקים פתוגנים. העיקרון הליך הכולל נשאר אותו הדבר. בנוסף, שיטה זו עשויה להועיל לחוקרים המבקשים ללמוד פלט התפקודית של התאים השומר לא רק לחיות חיידקים, אלא גם לגירויים אחרים בחומרים כימיים בתנאים לשמור על הסביבה הטבעית של העלה.

עלים שלמים יכול להיות קשה בשל עובי תמונה שלה טופוגרפיה אחידה. בעיה זו ניתן להקל על ידי הסרת ורידים באמצע העלה כך שהוא מניח שטוח בשקופית באמצעות מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, סוגים אחרים של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניתן להשתמש כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של פני השטח עלה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4864
טריפטון	Fisher Scientific	BP1421-1
תמצית שמרים	Difco Laboratories	0127-01-7
נתרן כלוריד	VWR international	7647-14-5
אגר	Bio Express	J637-2500G
תא גידול לצמחים
אינקובטור עם מנער
מיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקת לייזר