מאמר שיטה

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

DOI:

10.3791/2243

⸱

30 בדצמבר 2010

 ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University School of Medicine, 4Research Medicine, Veterans Affairs TVHS, Vanderbilt University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג הזברה התפתחה חזקה In vivo פלטפורמה פנוטיפ מבוססי מסכי סמים אנליזה כימית גנטית. הנה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה, מעשית להקרנה בקנה מידה גדול של מולקולות קטנות באמצעות עוברי דג הזברה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאור גודל העובר הקטן שלהם, הפיתוח המואץ, שקיפות, פוריות, ונקודות הדמיון המולקולרי, מורפולוגיים ופיזיולוגיים רבים יונקים, דג הזברה התפתחה חזקה

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1) דג הזברה אוסף ביצה

  1. באחר הצהריים שלפני יום של המסך כימיים, להקים 10-20 רבייה טנקים דג הזברה. ממלאים כל מיכל עם מים ממערכת מדגה. שימוש נטו דג, העברת זכר אחד בוגר 1-2 נקבות בוגרות למיכל הפנימי במיכל כל הרבייה. הפרד את הדג הזכר והנקבה זה מזה עם מחיצה. לייבל הכלובים לשים מכסה עליהם.
  2. בבוקרו של המסך, להסיר את המחיצות מטנקים הרבייה ולאפשר דג הזברה להזדווג. במשך שעה 1 הבא, לאפשר ביציות מופרות ליפול דרך רשת בתחתית המיכל הפנימי כל אחד.
  3. אחרי שעה 1, להחזיר דג הזברה הבוגרת חזרה מיכלי אחסון קבועים, להסיר את המיכל הפנימי לאסוף את הביצים על ידי מאמץ את המים במיכל כל הרבייה דרך מסננת תה פלסטיק.
  4. היפוך מסננת מעל צלחת פטרי ולשטוף את מסננת כדי לשטוף בעדינות את הביצים אל תוך צלחת פטרי באמצעות בקבוק המכיל לשטוף את המדיום E3.
  5. ביצים כל מופרית, אשר מופיעים אטום, יש להסיר בעזרת פיפטה פלסטיק חד פעמיות. כל אחד צריך לעבור הזדווגות להניב כ -200 עוברים.

2) עריכה עוברים 96-גם צלחות

  1. העברה על 5 עוברים בינוני E3 לבאר כל צלחת 96-היטב באמצעות פיפטה פסטר זכוכית.
  2. לאחר עוברים הם ערוכים לצלחת 96-היטב, להסיר כמה שיותר המדיום E3 כפי האפשרי של הבארות באמצעות ערוץ 12 (3-30 μL) פיפטה, נזהרת שלא לנקב את העובר. בעזרת פיפטה 12 ערוצים, לספק 250 μL של המדיום E3 המכיל kanamycin 0.5μg/ml זה טוב כמה שיותר מהר כדי לא לאפשר עוברים להתייבש.
  3. שים את לוחות 96-היטב 28.5 ° C החממה עד שהם מגיעים לשלב הרצוי כאשר תרכובות להתווסף.

3) העברת ספריית מולקולה קטנה

אמנם העברת המתחם יכול להיות אוטומטי עם שיטות העברת רובוטית, נתאר את שיטת העברה ידנית.

  1. ספריות מולקולה קטנה מסופקים בדרך כלל בפורמט 96-היטב, עם כל תרכובת מאוחסנים DMSO כמו מניה 10 מ"מ. כ -60 דקות לפני העוברים מגיעים לשלב שבו הם תרכובות להתווסף, הפשרה המספר הרצוי של 96-היטב צלחות המכילות aliquots של מולקולות קטנות (צלחת מקור). שימו לב מספר זיהוי סדרתי או אחר של צלחות המקור. כדי למזער עיבוי על הצלחות, מפשיר יכול להתרחש בתא התייבשות המכיל Drierite (WA המונד DRIERITE CO, קסניה, OH).
  2. ספין בקצרה את לוחות בצנטריפוגה השולחן מצויד מתאם רב גם צלחת.
  3. הסר את הסרט איטום אלומיניום מהצלחת המקור. בעזרת פיפטה 12 ערוצים, לדלל את התרכובות בצלחת מקור לריכוז של 0.5 מ"מ (לדוגמה, אם מתחילים עם 250 aliquots NL של המניה 10mm, להוסיף 4.75 μL של DMSO זה טוב).
  4. כאשר עוברים בצלחת 96-היטב (צלחת הנמען) מגיעים לשלב הרצוי, השתמש 12 ערוצים (20-20 μL) פיפטה להעביר 2.5μL של תרכובות (0.5mm) מהצלחות מקור לתוך צלחות הנמען המכיל את עוברים.
  5. רשום את מספר הזיהוי של מקור צלחות על צלחות העובר הנמען. מכסים את הצלחות הנמען עכשיו המכיל את העוברים ותרכובות עם מכסים, מערבבים בעדינות את הצלחות על ידי בעדינות מתערבל, ולמקם אותם בתוך 28.5 ° C חממה.
  6. כיסוי כל צלחת מקור המכיל מולקולות קטנות שאינן בשימוש (0.5 מ"מ) עם סרט אלומיניום איטום ומניחים במקפיא -80 מעלות צלזיוס עבור אחסון לטווח ארוך.

4) הקרנת עבור אפקטים של מולקולות קטנות, על ידי בדיקה ויזואלית של פנוטיפים

  1. לפני ביצוע המסך, לגבש אמת מידה ספציפית מה יהווה "מכה".
  2. לפעמים הרצוי בפיתוח, להסיר את פלטות 96-תרכובת המכילה גם מטופלים העוברים מן החממה ולבחון היטב תחת כל stereomicroscope. עבור ויזואליזציה טובה יותר של שינויים עדינים, כגון שינויים בדפוס הדם, מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך יכול לשמש. מיקרוסקופיה פלורסנט יכול לשמש כדי לבחון ההפרעות הביטוי של ה-GFP או חלבונים DsRed תחת האמרגן רקמות ספציפיות.
  3. במהירות הסריקה 96-היטב הצלחות גם כל אשר לפחות 3 מתוך 5 עוברים התערוכה הקבועה פנוטיפ "מכה". הקלט את זהותו של הצלחת ומיקום טוב של כל נפגע פוטנציאלי.
  4. לאשרר להיט פוטנציאלי על ידי retesting על השפעותיה של התרכובת במינונים שונים (1 אממ, 5 UM, 10 מיקרומטר ו 50 מיקרומטר). עבור כל מנה, 10 עוברים נבדקים 0.5 מ"ל של התקשורת E3 בפורמט 48-היטב צלחת. עיתוי בנוסף מתחם עבור retesting צריך להיות זהה לזה של ההקרנה המקורי. מכה כאשר הוא אישר את הפנוטיפ שהושרו מתנוסס על retesting של compounד
  5. זהה את מתחם פגע ממסד הנתונים של מולקולות קטנות בספריה כימיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאשר מתכננים דג הזברה מסך מבוססי כימיים, תשומת לב מיוחדת יש לשלם חוסנו של פנוטיפ הנדונה לבין שיעור הרקע של פנוטיפ כזה. הדבר חשוב במיוחד עבור מסכי עבור מדכאי הכימי של פנוטיפ המושרה. לדוגמה, עבור פנוטיפ הנגרם על ידי אינדוקציה חום הלם transgene, מצב שגורם את הפנוטיפ reproducibly חייב להיות ממופה החוצה בדיוק לפני שיזם את המסך כדי למנוע גבוה בלתי מתקבל על הדעת שיעורי חיובי כוזב. עם תכנון קפדני, מסכי דג הזברה כימיים, אשר דורשים השקעות הון צנוע, יכולה להוביל לגילוי של אפנן הרומן של תא הא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
אין ניגודי אינטרסים הכריז.

חומרים

  1. מינימום של 20 זוגות של דג הזברה הבוגרת הגנוטיפ הרצוי.
  2. דג רשתות, טנקים רבייה, עם מיכל פנימי נשלף חוצצים (גידול Aquatic).
  3. צלחות פטרי (10 ס"מ).
  4. תה מסננת פלסטיק.
  5. לשטוף containg בקבוק מים העובר.
  6. פנויה להעביר פוליאתילן pipettes.
  7. פוליסטירן 96-היטב מסביב לתחתית assay צלחות (קורנינג שחקן המשנה; לואל, MA).
  8. זכוכית פיפטה פסטר (פישר סיינטיפיק).
  9. משאבה ידנית פיפטה, 10 מ"ל (Bel-Art מוצרים, Pequannock, NJ).
  10. העובר בינוני E3: 5 mM NaCl, KCl mM 0.17, 0.33 mM CaCl 2, 0.33 mM MgSO 4, המכיל 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma, סנט לואיס, מיזורי). PTU יכול להיות מוכן כפתרון 10x ידי המסת 0.3 גרם PTU ב L 1 של מדיה העובר E3. פתרונות המכיל PTU צריך להיות מוגן מפני אור על ידי כיסוי עם רדיד אלומיניום.
  11. 12 ערוצים pipettes, 20-20 μL (Eppendorf).
  12. 12 ערוצים pipettes, 300-300 μL (Eppendorf).
  13. פנויה פוליסטירן פיפטה אגן, 50 מ"ל (פישר סיינטיפיק).
  14. מולקולה ספרייה קטנה של תרכובות שונות מבנית ערוכים בפורמט 96-wll בבית מניות 10 מ"מ DMSO. צלחת כל אב aliquoted תוך 96-היטב אחסון צלחות פוליפרופילן (קורנינג), ומאוחסנים ב -80 ° C עד השימוש.
  15. אלומיניום איטום סרט עבור 96-היטב צלחות (Nunc, רוצ'סטר, ניו יורק).
  16. DMSO (Sigma, סנט לואיס, מיזורי).
  17. יסוד חממה, 28.5 ° C (פישר סיינטיפיק).
  18. Stereomicroscope עם בסיס האור המועבר (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bayliss, P. E. Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish. Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).
  2. Burns, C. G. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
  3. Hao, J. In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors. ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).
  4. Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling. Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).
  5. Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107, 1355-1358 (2003).
  6. Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).
  7. Yu, P. B. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).
  8. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature reviews. 4, 35-44 (2005).
  9. Stern, H. M. Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant. Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).
  10. Peterson, R. T. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

96Hedgehog

מאמרים קשורים