מאמר שיטה

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

DOI:

10.3791/2243

⸱

30 בדצמבר 2010

 ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University School of Medicine, 4Research Medicine, Veterans Affairs TVHS, Vanderbilt University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג הזברה התפתחה חזקה In vivo פלטפורמה פנוטיפ מבוססי מסכי סמים אנליזה כימית גנטית. הנה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה, מעשית להקרנה בקנה מידה גדול של מולקולות קטנות באמצעות עוברי דג הזברה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאור גודל העובר הקטן שלהם, הפיתוח המואץ, שקיפות, פוריות, ונקודות הדמיון המולקולרי, מורפולוגיים ופיזיולוגיים רבים יונקים, דג הזברה התפתחה חזקה

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1) דג הזברה אוסף ביצה

  1. באחר הצהריים שלפני יום של המסך כימיים, להקים 10-20 רבייה טנקים דג הזברה. ממלאים כל מיכל עם מים ממערכת מדגה. שימוש נטו דג, העברת זכר אחד בוגר 1-2 נקבות בוגרות למיכל הפנימי במיכל כל הרבייה. הפרד את הדג הזכר והנקבה זה מזה עם מחיצה. לייבל הכלובים לשים מכסה עליהם.
  2. בבוקרו של המסך, להסיר את המחיצות מטנקים הרבייה ולאפשר דג הזברה להזדווג. במשך שעה 1 הבא, לאפשר ביציות מופרות ליפול דרך רשת בתחתית המיכל הפנימי כל אחד.
  3. אחרי שעה 1, ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאשר מתכננים דג הזברה מסך מבוססי כימיים, תשומת לב מיוחדת יש לשלם חוסנו של פנוטיפ הנדונה לבין שיעור הרקע של פנוטיפ כזה. הדבר חשוב במיוחד עבור מסכי עבור מדכאי הכימי של פנוטיפ המושרה. לדוגמה, עבור פנוטיפ הנגרם על ידי אינדוקציה חום הלם transgene, מצב שגורם את הפנוטיפ reproducibly חייב להיות ממופה החוצה בדיוק לפני שיזם את המסך כדי למנוע גבוה בלתי מתקבל על הדעת שיעורי חיובי כוזב. עם תכנון קפדני, מסכי דג הזברה כימיים, אשר דורשים השקעות הון צנוע, יכולה להוביל לגילוי של אפנן הרומן של תא הא.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
אין ניגודי אינטרסים הכריז.

חומרים

  1. מינימום של 20 זוגות של דג הזברה הבוגרת הגנוטיפ הרצוי.
  2. דג רשתות, טנקים רבייה, עם מיכל פנימי נשלף חוצצים (גידול Aquatic).
  3. צלחות פטרי (10 ס"מ).
  4. תה מסננת פלסטיק.
  5. לשטוף containg בקבוק מים העובר.
  6. פנויה להעביר פוליאתילן pipettes.
  7. פוליסטירן 96-היטב מסביב לתחתית assay צלחות (קורנינג שחקן המשנה; לואל, MA).
  8. זכוכית פיפטה פסטר (פישר סיינטיפיק).
  9. משאבה ידנית פיפטה, 10 מ"ל (Bel-Art מוצרים, Pequannock, NJ).
  10. העובר בינוני E3: 5 mM NaCl, KCl mM 0.17, 0.33 mM CaCl 2, 0.33 mM MgSO 4, המכיל 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma, סנט לואיס, מיזורי). PTU יכול להיות מוכן כפתרון 10x ידי המסת 0.3 גרם PTU ב L 1 של מדיה העובר E3. פתרונות המכיל PTU צריך להיות מוגן מפני אור על ידי כיסוי עם רדיד אלומיניום.
  11. 12 ערוצים pipettes, 20-20 μL (Eppendorf).
  12. 12 ערוצים pipettes, 300-300 μL (Eppendorf).
  13. פנויה פוליסטירן פיפטה אגן, 50 מ"ל (פישר סיינטיפיק).
  14. מולקולה ספרייה קטנה של תרכובות שונות מבנית ערוכים בפורמט 96-wll בבית מניות 10 מ"מ DMSO. צלחת כל אב aliquoted תוך 96-היטב אחסון צלחות פוליפרופילן (קורנינג), ומאוחסנים ב -80 ° C עד השימוש.
  15. אלומיניום איטום סרט עבור 96-היטב צלחות (Nunc, רוצ'סטר, ניו יורק).
  16. DMSO (Sigma, סנט לואיס, מיזורי).
  17. יסוד חממה, 28.5 ° C (פישר סיינטיפיק).
  18. Stereomicroscope עם בסיס האור המועבר (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bayliss, P. E. Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish. Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).
  2. Burns, C. G. High-throughput assay for small molecules tha....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

96Hedgehog

מאמרים קשורים