מאמר זה מתאר את המתודולוגיה כדי לקבוע את התגובה chemotactic של לויקוציטים אל ligands ספציפיים לזהות אינטראקציות בין משטח קולטני התא וחלבונים cytosolic באמצעות טכניקות הדמיה תא חי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בזמן אמת הדמיה של leukotriene B 4 Cell Migration מתווכת ו BLT1 אינטראקציות עם β-arrestin
במאמר זה
סיכום
תקציר
קולטני G-חלבון בשילוב (GPCRs) שייכים למשפחת seven חלבון הטרנסממברני ולתווך התמרה של אותות תאיים לתגובות תאיים. GPCRs לשלוט תפקודים ביולוגיים מגוונים כגון chemotaxis, שחרור סידן תוך תאי, ויסות הגנים באופן ליגנד תלוי דרך heterotrimeric G-חלבונים 1-2. ליגנד גורם מחייב סדרה של שינויים קונפורמציה המוביל heterotrimeric ההפעלה של ה-G-חלבונים לווסת את רמות שליחים second כגון monophosphate מחזורי אדנוזין (cAMP), אינוסיטול טריפוספט (IP3) וגליצרול diacyl (DG). בד בבד עם הפעלת הכריכה ליגנד לקולטן גם יוזם סדרה של אירועים, כדי לרכך את הקולטן איתות באמצעות קיבוע הפחתת רגישות, ו / או הפנמה. תהליך הפחתת רגישות של GPCRs מתרחשת באמצעות זירחון רצפטור על ידי G-חלבון קולטן קינאז (GRKs) ומחייבת הבאות של β-arrestins 3. β-arrestins הם חלבונים cytosolic ו translocate קרום על הפעלת GPCR, קשירה לקולטנים פוספורילציה (ברוב המקרים) לשם הקלת הפנמה קולטן 4-6.
Leukotriene B 4 (LTB 4) הוא מולקולה הפרו דלקתי שומנים שמקורם מסלול חומצה arachidonic ומתווך פעולותיה באמצעות GPCRs, LTB 4 קולטן 1 (BLT1; קולטן זיקה גבוהה) ו LTB 4 קולטן 2 (BLT2; קולטן זיקה נמוכה ) 7-9. מסלול 4-BLT1 LTB הוכח להיות קריטי מספר מחלות דלקתיות, כולל דלקת מפרקים אסטמה, טרשת עורקים 10-17. המאמר הנוכחי מתאר את מתודולוגיות שפותחו כדי לפקח LTB 4-Induced הגירה ליקוציט ואת האינטראקציות של BLT1 עם β-arrestin ו, טרנסלוקציה קולטן בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ טכניקות הדמיה 18-19.
מוח העצם נגזר מן התאים הדנדריטים C57BL / 6 עכברים בודדו בתרבית כפי שתואר לעיל 20-21. תאים אלו נבדקו שיטות הדמיה לחיות תא להפגין LTB 4 הגירה המושרה תא. BLT1 האדם היה מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי אדום (BLT1-RFP) בתחנה הסופית-C ו-β-arrestin1 מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (β-arr-GFP) ו transfected הן פלסמידים לתוך עכברוש Basophilic Leukomia (RBL-2H3) שורות תאים 18-19. קינטיקה של האינטראקציה בין החלבונים האלה ולוקליזציה נוטרו באמצעות מיקרוסקופ וידאו חי התא. מתודולוגיות במאמר הנוכחי מתארים את השימוש בטכניקות מיקרוסקופיות לחקור את התגובות תפקודית של G-חלבון קולטנים יחד בתאים חיים. המאמר הנוכחי מתאר גם את השימוש Metamorph התוכנה לכמת את עוצמות הקרינה כדי לקבוע את הקינטיקה של הקולטן אינטראקציות חלבון cytosolic.
פרוטוקול
מתודולוגיה
תיאור של מיקרוסקופ
חיים הדמיה ניסויים תא שבוצעו באמצעות TE-FM Epi-Fluorescence המערכת מחוברת מיקרוסקופ Nikon הפוך Eclipse TE300. מיקרוסקופ המצויד בשלב החימום. הצמד מגניב HQ דיגיטלי B / W CCD (רופר מדעי) המצלמה LAMDA 10-2 מחליף מסנן אופטי (חברה סאטר מכשיר) מחובר מיקרוסקופ. אורכי גל עירור ופליטה נשלטים עם גלגלים לסנן נשלט על ידי בקר 10-2 גלגל Lamba לסנן, סאטר מכשירים ושות זמן חשיפה 500 ms צריך להיות מספיק כדי להציג RFP או ה-GFP בתאים חיים. בקרת חומרה רכישת תמונות נשלטים על ידי תוכנה Metam....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הדמיה תא חי הוא כלי רב עוצמה כדי להדגים את הפונקציה ואת האינטראקציות של חלבונים מסוימים כפי שהם מתרחשים בזמן אמת. השיטות שתוארו בכתב היד הזה מראים בבירור כי LTB 4 יכול לגרום להגירה מהירה של תאים דנדריטים. שיטות אלה לא רק להרחיב את ההיבטים של פונקציה 4 LTB לסוגי תאים שונים, הם מאפשרים בשיטות דומות כדי להיות מיושם על מגוון רחב של chemokines אחרות ובדיקת יעילותם כסוכני chemotactic על תת אוכלוסיות שונות ליקוציט. דימות פלואורסצנטי במערכת זו מאפשר ניטור אירועים אית.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
המחקר נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים AI-52381, CA138623 וקנטקי לחקר סרטן הריאות פורום תמיכה מוסדית של ג'יימס גרהאם בראון Cancer Center.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שבץ תאי לוקמיה בסיפילים של חולדה (RBL-2H3) או תאי HEK293. | ATCC | CRL-2256 | |
| דלבקו (Delbecco)’Eagle המשונה’מצע DMEM (DMEM Medium) | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI או DMEM ללא פנול אדום | Invitrogen | 11835-030 | |
| סרום עוברי בקר | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-גלוטמין (200 mM) | Invitrogen | 25030 | |
| פניצילין-סטרפטומייצין (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | |
| טריפסין, 0.05% (1X) עם EDTA 4Na, נוזל | Invitrogen | 25300 | |
| HEPES (1M) | Invitrogen | 15630 | |
| צלוחיות Fluoro סטריליות בעלות תחתית זכוכית של כיסוי (בעובי 0.17 מ"מ) בקוטר 35 מ"מ (WillCo-dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| קובית Gene Pulser סטרילית (מרווח אלקטרודות של 0.4 ס"מ) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | |
| מכשיר אלקטרופורציה Gene Pulser II | Bio-Rad | ||
| מערכת Epi-Fluorescence מדגם TE-FM המחוברת למיקרוסקופ הבלתי תלוי Nikon Eclipse TE300 | Nikon Instruments | ||
| תוכנת Metamorph | דימות אוניברסלי | ||
| מכשיר למשיכת מיקרו-פיפטות אנכי | Narishige International | ||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | ||
| מיקרו-מניפולטור הידראולי MO-188NE | Narishige International | ||
| מניפולטור ידני גס, MN-188NE | Narishige International | ||
| <חזק>מבני cDNA: | |||
| cDNA של קולטן המצומד לג'י-פרוטאין המסומן בחלבון פלואורסצנטי אדום בקצה ה-C (hBLT1-RFP) | ג'אלה ואחרים 2005 | ||
| cDNA של חלבון ציטוזולי המסומן ב-GFP (β(-arrestin1-GFP במחקר הנוכחי). | ג'אלה ואחרים 2005 |
מקורות
- Wess, J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 11, 346-354 (1997).
- Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved i....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
