מאמר שיטה

הקלטות פיזיולוגיים של NMJs פלט גבוה ונמוך על שרירים ברגליים סרטן הנהרות extensor

14.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/2319

⸱

17 בנובמבר 2010

 , 
1Department of Biology, University of Kentucky

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מדגים כיצד לנהל הקלטות אלקטרו התגובות הסינפטי על השרירים extensor ברגל הליכה של סרטן וכיצד מסופי העצב הם דמיינו כדי להראות את ההבדלים המורפולוגיים ברוטו גבוהה ונמוכה פלט מסופים עצב.

תקציר

אנחנו מסבירים בפירוט כיצד לחשוף לנהל הקלטות אלקטרו התגובות הסינפטי גבוה (phasic) נמוך (טוניק) מנוע נוירונים פלט innervating השרירים extensor ברגל הליכה של סרטן נחלים. הבדלים ברורים נמצאים הפיזיולוגיה והמורפולוגיה של מסופי העצב phasic טוניק. האקסון טוניק מכיל מיטוכונדריה רבים יותר, המאפשרים לה לקחת חיוני כתם בעוצמה רבה יותר מאשר האקסון phasic. מסופי טוניק יש ורידים, ואת הטרמינל phasic הוא filiform. מסופי טוניק נמוכים היעילות הסינפטית אבל להראות תגובות הקל דרמטי. לעומת זאת, מסופי phasic גבוהות של יעילות quantal אלא להראות דיכאון סינפטיים עם גירוי בתדירות גבוהה. התפוקה נמדדת quantal עם אלקטרודה macropatch המוקד ממוקם ישירות על מסופי העצב דמיינו. שני מסופי phasic טוניק innervate סיבי השריר זהה, אשר טוען כי הבדלים הטבועים נוירונים, ולא משוב ההפרש מדרדר מן השריר, להסביר ההבחנה מורפולוגיים ופיזיולוגיים.

פרוטוקול

1) מבוא

עצב מוטורי לתקשר עם סיב שריר ב סינפסות אשר יכונו צומת neuromuscular (NMJ). NMJs ניתן לגשת בקלות בהכנות שריר ביותר סרטנים. רבים NMJs סרטנים להוכיח שאינם spiking postsynaptic פוטנציאלים מעוררים (EPSP) דומה את האותות החשמליים מדורגים שנוצר דנדריטים postsynaptic בתוך מערכת העצבים המרכזית יונקים או התגובות התת ציין NMJs חוליות (Wiersma & Van Harreveld, 1938; כץ & Kuffler, 1946) . NMJs סרטנים יכולים לשמש מודלים הסינפטי הבסיסית לספק תובנות כלליות לתוך בשידור סינפטי והבחנה הסינפטי.

באופן כללי, יחידות מוטוריות להסדיר היבטים של התנהגות בעלי חיים באמצעות סוג של תקשורת סינפטית ב NMJs ומאפיינים של השרירים. מאז התצפית הראשונה של "מהיר" התכווצויות "איטי" שריר סרטנים סרטנים שריר מקרוב (לוקאס, 1907, 1917), התכווצות שרירים הבחנה דומה תוארה שריר סוגי סרטנים אחרים כגון מכופפי בטן (קנדי & טאקדה, 1965a , ב) ו פושטי איבר (ואן Harreveld & Wiersma, 1936). "מהיר" התכווצויות ליזום מענה מהיר. לדוגמה, להעיף זנב סרטנים היא התנהגות מהר. "איטי" התכווצויות לשמור על תנועות איטיות לסייע בשמירה על היציבה (Bradacs et al. 1997). מקבילים על "מהיר" התכווצויות "איטי" שרירים ", phasic / פלט גבוה" ו "פלט טוניק / נמוך" משמשים באופן נרחב כדי לתאר את הנוירונים המנוע. ההבדל בשיעור והעיתוי של התכווצות שרירים היא בחלקה הקשורים presynaptic הבדלים במבנה הסינפטי וכוח הסינפטי (King et al. 1996). Myofibrillar איזופורם ביטוי החלבון חשוב גם הבדלים התכווצות, אך ההכנות כמו זה של שריר פושטי רגל, שבו הוא נתון סיב מעוצבבים על ידי שני סוגים של נוירונים מוטוריים, הדגש הוא על הבדלים סינפטיים של המסופים, מאז מסופי המניות תא היעד זהה (Mykles et al., 2002). מחקר מוקדם יותר בדק את שני האקסונים מנוע הגירוי של פושטי הרגל ותיאר את פנוטיפים phasic טוניק (Bradacs et al. 1997). בדו"ח זה, אנו מדגימים כיצד לבצע את הנתיחה ולקבל הקלטות כדי שאחרים יוכלו להמשיך לחקור את המאפיינים של בידול הסינפטי אלה מסופי העצב.

נצפה עם במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, סדרות שונות של חלקים המתקבלים טוניק ומסופי phasic על שריר הרגל סרטנים extensor גילה כי מסופי טוניק להכיל יותר מאשר שלפוחית ​​RRP מסופי phasic; המיטוכונדריה הם שכיחה יותר נוירונים טוניק, ואת סינפסות על מסופי phasic הם מורכבות יותר מאשר אלו על סינפסות, תפוקה נמוכה, שכן הם מכילים מספר רב של אזורי פעילות מגוונת עם המרווח (Miller et al, 2002; ג'ונסטון et al, 2008;. King et al, 1996;.. Bradacs et al, 1997). נמוך פלט טוניק מסופי הם גם רגישים יותר בשידור סינפטי שיפור עם neuromodulator סרוטונין (5-HT) מאשר הם מסופי phasic (Cooper et al., 2003).

העובדה טוניק ו NMJ phasic נמצאים על סיבי השריר באותו מקל כדי להעריך את ההבדלים presynaptic על סיבי שריר נתון במטרה לענות על שאלות של עייפות שרירים, דיכאון הסינפטי ולדבר לחצות הסינפטי. שאלות שונים להישאר לטפל בהכנה זו, כגון אם יש הבדלים בצפיפות הקולטן postsynaptic ואת קולטני גלוטמט תת מטרות postsynaptic עבור טוניק ומסופי phasic, אלא הבנה טובה יותר של הבדלים בסיסיים באנטומיה ופיזיולוגיה של אלה שתי יחידות מוטוריות יסייע בבניית בסיס ידע עמוק יותר. התקווה היא כי עקרונות היסוד למדו לקראת זה הסינפטי יחולו סינפסות אחרות בהכנות שונים ישפר חקירות בעתיד במודל זה סינפטיים של סרטנים.

2) שיטות

  1. כל הניסויים נערכים על הרגליים בהליכה הראשון או השני של סרטנים בינוניים (Procambarus כלארקיי). החיות הם שוכנו בנפרד במכלי פלסטיק עם מים מחומצן. טמפרטורת החדר היא חיה בטווח של 13 ° C-16 ° C. בעלי החיים ניזונים עם מזון דגים יבש המים השתנו על בסיס שבועי.

    איור 1
    איור 1: סכמטי של רגל סרטנים הליכה שישה קטעים דיסטלי.
  2. ההיבט דיסטלי של הרגל הליכה סרטנים מחולק מבחינה אנטומית לתוך שישה מקטעים (איור 1). פושטי הרגל ממוקם meropodite, ואת פקעת עצבים כי יהיה מבודד הוא קרוב ischiopodite meropodite משותף. האקסון טוניק או phasic יכול להיות מגורה באופן סלקטיבי כמו needed לצרכים פיזיולוגיים לאחר שהם נחשפים.
  3. קופר וקופר (2009) תיאר כמה היבטים של הניתוח הראשוני, כולל שיטות חשיפת מעורר של הנוירון המוטורי פותחן בתוך האזור meropodite, אבל התיאור שלהם אינו מספק את הטיפול הנדרש להגנה על השרירים extensor מפני נזקים, כפי שהיה לא צריך להתייחס הכנה שריר פותחן. על מנת להגן על extensor, הליכה ברגל הראשון או השני יוסר סרטנים, מדידה 6-10 ס"מ אורך הגוף (Atchafalaya ביולוגית אספקת ושות, Raceland, לוס אנג'לס), על ידי גרימת את בעל החיים automize האיבר עם צביטה חזקה דיסטלי למישור השבר במגזר ischiopodite. הרגל מונחת על הצלחת דיסקציה עם לרוחב (הצד החיצוני) מול הצופה. הרגל הוא הסתובב עד שהצופה יכול להיות בטוח החיצון (צד לרוחב) הוא פונה כלפי מעלה על הצלחת הניתוח, בדרך כלל עם הצד קשתי כלפי מעלה (איור 2). הנחת רגל על ​​פיסת נייר, קל יותר להפוך את ההכנה תוך ביצוע קיצוצים אלה.

    איור 2
    איור 2: הצד הלטרלי של meropodite, בדרך כלל הצד אשר מקושת, הוא פונה כלפי מעלה על הצלחת הניתוח.
  4. עם מפסק להב בעל אזמל, סכין גילוח חד משמש לציפורן לחרוט עד עתה חיתוך דרך בדפוס שמוצג באיור 3 עבור מגזר meropodite. הטיפול נלקח לא לחתוך יותר מדי רחוק דיסטלי על הגב כדי לחתוך הגחון על ידי המפרק meropodite-carpopodite.

    איור 3
    איור 3: קטע meropodite עם קווים כתבנית הציע תחריט מחלון לציפורן.


    הכנה ממוקם מלוחים. המנה לנתיחה צריך ציפוי (Dow Corning) Sylgard בתחתית (1cm עבה). Sylgard משמש כך סיכות החרק יכול להיות תקועה בו לקיום הכנה עדיין. בשלב זה, סיכה תקוע באמצע קטע carpopodite ו בהיבט הגבי של המגזר ischiopodite (איור 4). ההכנות גזור שטופים מלוחים סרטנים רגיל, שונה מן הפתרון של ואן Harreveld (1936), אשר הוא עשה עם 205 NaCl; 5.3KCl; 13.5 CaCl 2: 2H 2 O, 2.45 MgCl 2: 6 שעות 2 O; 5 HEPES והותאמו pH 7.4 (מ"מ).


    איור 4
    איור 4: קטע meropodite עם חלון לחתוך להיות המריא. שים לב למיקום של סיכות לנתיחה.
  5. לציפורן היא הרימה בעדינות באזור דיסטלי ואת סיבי השריר מנותקים לציפורן על ידי ביצוע משיכות לעבר בסיס של הרגל. לציפורן ניתן המריא.
  6. Apodeme (גיד) הוא חתך במפרק meropodite-carpopodite. סיכה מושם על המשטח הפנימי של גיד מכופף כדי להראות היכן לחתוך את תיעשה (איור 5). גיד הוא צבט אז איפה זה היה לחתוך עם פינצטה את השריר מכופף הוריד ידי הרמתה לכיוון הזנב (איור 6), חשיפת עצבים רגל הראשי השרירים פושטי.

    איור 5
    איור 5: apodeme של שריר מכופף מסומן על ידי לעקירתם אותו מכופף עם סיכה.


    איור 6
    איור 6: apodeme של שריר מכופף היא לחתוך ולהסיר בזהירות שלא לגרום נזק עצבי ברגל הראשי.
  7. עצב הרגל העיקרית היא לחתוך במפרק meropodite-carpopodite ומשך בזהירות לאחור על השריר extensor. המשטח המדיאלי של השריר משמש לאורך כל תקופת המחקר הזה. ההפרדה של העצב לשריר פושטי רגל מן העצב העיקרי ניתן לשפר על ידי משיכתו בעדינות את הגדם דיסטלי של העצב רגל הראשי לצד ההכנה. כאשר קילוף העצב הרגל העיקרי חזרה מעל השריר extensor, ענפים קטנים של האקסון ייתכן שיהיה צורך לחתוך. אלה הם ענפים מן הנוירון המוטורי מעכבות לשריר extensor. צרור גדול מסתעפת מן העצב הרגל העיקרי לקראת סוף הפרוקסימלי של meropodite הוא צרור עצבים קטנה של עניין.

    איור 7
    איור 7: העצב הרגל העיקרי הוא לגזור לאחור לכיוון פרוקסימלי.


    חבילה זו ניתן לראות את העצב עם מכתים מתילן כחול (איור 8) או עם 4-Di-2-ASP פלורסנט כתם (איור 9).


    איור 8
    איור 8: מוכתמים שרירים פושטי עם מתילן כחול. הערה ההסתעפות האקסון ושני אקסונים לעין בקלות בתוך העצב. החיצים האדומים demark המסלול העצבי.


    איור 9
    איור 9: אקסונים של מוכתם העצב המוטורי עם 4-Di-2-ASP. האקסון טוניק הוא יותר נראה בהיר בגלל התוכן המיטוכונדריה מוגברת.


    איור 10A איור 10A: מסופי בודדת של נוירונים phasic טוניק מוכתם 4-Di-2-ASP. שים לב ורידים על מסופי טוניק ואת אופי דקה של מסופי phasic.


    איור 10B
    איור 10 ב-טוניק ציין


    איור 10C
    איור 10C-Phasic ציין

3) פיזיולוגיים פרופילים

  1. כדי לבחון את הפוטנציאל postsynaptic מעוררים (EPSPs) של הנוירונים טוניק או phasic, אחד אקסונים מבודד צרור העצבים מגורה על ידי אלקטרודה יניקה (איור 11) מחובר ממריץ הדשא בעוד הפוטנציאלים תאיים בשריר מנוטרים (ג'ונסטון et al. 2008). גירוי ב 70 הרץ מוחל על האקסון טוניק על מנת לקדם מענה הקלו על NMJs תפוקה נמוכה, או דופק אחד (1 הרץ) מוחל על האקסון phasic כדי להשיג EPSPs גדול מהתפוקה הגבוהה NMJs כפי שמוצג באיור 12. EPSPs נרשמות למחשב באמצעות ממשק PowerLab/4s.

    איור 11
    איור 11: אלקטרודה מגרה הניח על האקסון יחיד בתוך צרור העצבים. הערה הקו הירוק מתאר את 2 אקסונים הראשי.


    איור 12
    איור 12: פוטנציאל Postsynaptic (EPSPs) של הנוירונים טוניק או phasic כפי שמתקבלות על ידי הקלטות תאיים.
  2. חקירת אופי של סיוע הסינפטי ודיכאון הסינפטי ניתן לגשת באמצעות פרדיגמות שונות ניסיוני עם NMJs פלט נמוך וגבוה. סיוע של NMJs תפוקה נמוכה תלוי בתדירות, כפי שמוצג על פולסים 20, 40 ו - 60 הרץ של כ 20 גירויים (איור 13).

    איור 13
    איור 13: EPSPs בתגובה רכבת פולסים של גירוי נתון בשלושה תדרים שונים 20, 40 ו - 60 הרץ ב סרטנים מלח רגיל.
  3. שיעור הדיכאון הסינפטי לתדר הגירוי קשורה גם NMJs תפוקה גבוהה. איור 14 מראה הרץ רציף 5 של גירוי מדכא NMJ מעל 30 דקות. עם תדירות גירוי גבוה, כהכנה יהיה לדכא במהירות רבה יותר (Bradacs et al. 1997).

    איור 14
    איור 14: משרעת EPSP התגובה phasic במהלך גירוי 5 הרץ לגרום לדיכאון.

4) תגובות Quantal

  1. הליך דומה לזה שתואר על השריר פותחן של סרטנים (קופר קופר, 2009) משמש כהכנה זה. EPSPs quantal ישירות על אזורים זיהוי של המסוף עצב נרשמות על ידי הנחת לומן של האלקטרודה המאקרו תיקון הקלטה על ורידים הסינפטי דמיינו עם צבע החיוני 4-Di-2-ASP (5 מיקרומטר, 5 דק 'טיפול, קופר et al, 1995;. Magrassi et al, 1987).. ספונטני, כמו גם התגובות quantal עורר ניתן להקליט לאורך מסופי העצב. עורר פוטנציאל הסינפטי ספונטנית נרשמות עם אלקטרודה המאקרו התיקון (דוד 'ל, 1981; Wojtowicz et al, 1991;. Mallart, 1993). Kimax זכוכית (קוטר חיצוני: 1.5 מ"מ) היה משך אש מלוטש לייצר טיפים תיקון בקטרים ​​הנעים בתוך 10-20 מיקרומטר (איור 15).

    איור 15
    איור 15: לומן של האלקטרודה המאקרו תיקון ההקלטה.


    לומן של האלקטרודה מלא המדיום ים. מגבר הוא זהה לזה המשמש את ההקלטות תאיים שהוזכרו לעיל. אלקטרודה והתנגדות חותם ניתן לקבוע על ידי העברת פולסים המבחן הנוכחי דרך האלקטרודה. בניסויים שלנו, התנגדויות חותם נע בין 0.3 ל 1.0 MOhm ואת התנגדות אלקטרודה נע בין 0.5 ל 1.0 MOhm. התנגדות חותם ניתן לנטר ברחבי ההקלטה.
  2. ספירה ישירה של אירועים quantal אפשרי עם תדרי גירוי נמוך. עבור כל תשובה עורר, במספר האירועים quantal ניתן לקבוע בקלות את מסופי תפוקה נמוכה (איור 16). אלה סעיפים ישיר יכול לעזור להעריך את תוכן quantal אומר (דל קסטילו & Katz, 1954;. Cooper et al, 1995). מאז NMJs עורר תפוקה גבוהה לייצר רב quantal אירועים עורר, את המשרעת אזור מתכוון או של סטיות, יחד עם משרעת באזור השיא הממוצע או האירועים ספונטנית, יכול לשמש כדי approximate התוכן quantal אומר (Cooper et al. 1995).

    איור 16
    איור 16 עקבות מיקוד רשמה phasic ו NMJ טוניק.

    איור 17
    איור 17

דיון

אנחנו הוכיחו בדוח זה איך לנתח, לתעד ולכמת התגובות הסינפטי כהכנה סרטנים ייחודיים neuromuscular שבה מסופי שניהם גבוהה ונמוכה פלט innervate את סיב השריר אותו. ההכנות neuromuscular ב סרטנים מציעים יתרונות רבים על פני צמתים חוליות neuromuscular, שכן רק מעט נוירונים מנוע מעוררות יש צורך innervate שריר, ומאז הנוירונים ניתנים לזיהוי מתוך הכנה הכנה (אטווד, 1976). בנוסף, הנוירוטרנסמיטר גלוטמט הוא מעורר, ואת הפוטנציאלים postsynaptic מעורר (EPSP) מדורגות, ולכן מאפייני biophysical של אירועים הם מדורגים מקביל הדנדריטים של נוירונים בתוך מערכת העצבים המרכזית של בעלי חוליות. זרמי quantal, לעומת זאת, ניתן לנטר ישירות באתרי postsynaptic (Cooper et al. 1995).

גירויים חוזרים ונשנים 5 הרץ של העצב phasic מעורר EPSPs גדול להיות מדוכא מאוד לאחר מספר דקות. סוג זה של דיכאון נפוץ arthropod phasic neuromuscular צמתים (אטווד קופר, 1996). הנוכחות של מסופי טוניק לצד מסופי phasic מאפשרת להעריך האם או לא היעד postsynaptic הוא שונה מאוד במהלך ואחרי דיכאון של הנוירון המוטורי phasic. בנוסף, מסופי תפוקה נמוכה לספק הכנה נחמד לחקור המנגנונים העומדים בבסיס הנחיית הסינפטי (דסאי, השאה et al, 2008;. דסאי, השאה קופר, 2009)

מסופי תפוקה גבוהה מספקים קרקע לשחק לחקור אפנון בשיעור של דיכאון הסינפטי ועל תהליך ההחלמה. ההכנות נגיש ובר קיימא אמור לעזור בפענוח המנגנונים מאחורי דיכאון הסינפטי. בכך הכנה רגל סרטנים extensor, יישום אקסוגני של סרוטונין הוא כלי נוסף כדי לחקור התאוששות של דיכאון הסינפטי ואפשרות אמצעי לקידום חקירת גיוס של בריכות שלפוחית ​​סינפטית. הכנה זו מספקת יתרונות ניסיוניים אחדים, מאז סיבי שריר בודדים מעוצבבים על ידי נוירונים המנוע הן phasic טוניק.

מאז סרוטונין מגדילה את מספר שלפוחית ​​שפורסמו עם גירוי מעורר, ומאז הוא מקדם את ההחלמה במהלך דיכאון, ברור כי יש אפנון של בריכות שלפוחית ​​לשיפור ההסתברות של התמזגות עם ההווה סרוטונין (ג'ונסטון et al. 2008 ; לוגסי ואח', 2006;. ניצוצות et al, 2004).. מודלים שיסבירו את הדינמיקה של בריכות שלפוחית ​​בתוך הטרמינל עצב presynaptic במהלך גירוי בתדר נמוך, בניגוד למצב מדוכא, גם צריך להיחשב בין פרוטוקולי הניסוי השונים אפשרי עם הכנה זו.

זה כבר ציין מערכות אחרות כי כ -30% הבריכה שלפוחית ​​עובר מיחזור מהיר, בעוד שאר שלפוחית ​​ממוחזרים לעבור נתיב מיחזור המסורתית איטי דרך reticulum endoplasmic (Harata et al, 2001;. צ'יין et al. , 2001). נתיבי כפול כזה עשוי גם להיות נוכח במערכת זו. אם ה-ATP חסר במדינה מדוכאת של המסוף presynaptic, אז עגינה undocking לא יוכל להתרחש, ולכן שלפוחית ​​פרקו ועוד יישאר על פני השטח הסינפטי. מאז שלפוחית ​​יותר משתחררים במהירות כאשר מסופי נחשפים HT 5, זה אינו ריאלי, כי עוד נמצאים בתוך הבריכה releasable בקלות (RRV). עם זאת, במדינה מדוכאת, עם הפחתת ה-ATP, עגינה ו undocking עשויים להיחסם אפילו בנוכחות של 5-HT, אשר פרקו שוב עלים שלפוחית ​​על פני השטח הסינפטי. מאז נתונים ראשוניים עולה כי שלפוחית ​​יותר משתחררים לאורך זמן עם חשיפה ממושכת HT 5 וגירוי, חלוקת הבריכה שלפוחית ​​מן השבילים מיחזור מהיר ואיטי עשוי להיות מוטה יש שלפוחית ​​המוסמכת לשחרור מחדש (מ ג'ונסטון et al. , 2008; לראות ביקורות, דסאי, השאה et al, 2008;. דסאי, השאה קופר, 2009)

עם הטכניקות של הקלטות macropatch מוקד של זרמים postsynaptic ואמצעים הקוונטים אחד מאזורים מוגדרים של הטרמינל עצב מוטורי, אפשר לשאול שאלות כדי לקבוע אם הדיכאון הסינפטי מתרחש כתוצאה של שלפוחית ​​פחות ששוחרר או בגלל שינויים של הפונקציה של קולטנים postsynaptic. הוכח כי שלפוחית ​​רגישים יותר היתוך NMJ phasic של הכנה זו לחשיפה סידן שווה (Miller et al. 2005), המהווה סביר גבוה יותר פירושו תוכן quantal של המסופים phasic (Msghina et al. , 1998, 1999). בנוסף, ההבדלים frequenin חלבון מחייב סידן (Jeromin et al. 1999) ו ultrastructure (המלך et al. 1996) לתרום ליעילות ההפרש הסינפטי (קופרet al., 2003).

לפני כמה מחקרים בחנו את הפנוטיפ שרירים של סיבי שריר פושטי (Bradacs et al, 1997;. Cooper et al, 2003).. השוואת תקנה של בידול שריר עבור סוגי סיבים טוניק טהורה phasic ב סרטנים סוגי סיבים מעורבים, כמו עבור extensor את הרגל כי הוא innervated עמומות, יוכל לספק רמזים הביטוי שריר פנוטיפ ורגולציה (LaFramboise et al, 2000;. סון et al, 2000;. Griffis et al, 2001;. Mykles et al, 2002)..

שאלות מהותיות רבות נותרו להתייחס בנוירוביולוגיה, והכנה זו עשויה לסייע בהתמודדות עם כמה מהם. נושאים מעטים עניין בתחום היום כי יכול להיות ניגש עם פושטי הרגל כוללים: 1) קביעת מנגנונים הסלולר העומדים בבסיס דיכאון הסינפטית בתוך מסופי תפוקה גבוהה (האם דיכאון בשל הפחתה של Ca2 + כניסה, חוסר מוסמך בקלות שלפוחית ​​releasable (RRV) בריכה, ו / או פתיחות postsynaptic שינו?) 2) קביעת תפקיד מכניסטית של 5-HT כאשר מיושם לאחר גיוס של דיכאון הסינפטי לקדם התאוששות מהירה יותר, ו 3) הקביעה האם הצורות של quantal זרמים הנובעים מסופי phasic מגרה נמצאים שינו במהלך גיוס של דיכאון כדי לטפל ברכיבים טרום ופוסט סינפטיים של דיכאון הסינפטי.

NMJ זו חשובה כדי מחקר מתמשך והחוקרים בעתיד כי זה מאפשר לנו לקבל מידע רלוונטי, כי כתובות המנגנונים זוטר של ביצועים הסינפטית, כפי שהיא נמדדת ישירות באתרי שחרור. מחקרים עדכניים בתחום זה היא מתן מידע על אפנון של דיכאון הסינפטי ע"י 5-HT ואת הדינמיקה של בריכות שלפוחית. נושאים אלה נוגעים את היסודות הבסיסיים של תמסורת הסינפטי רלוונטי כל מערכות עצביות.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

אנו מודים למר קרייג ד Slaven (המחלקה לאנגלית, אוניברסיטת קנטאקי) לסיוע העריכה. נתמך על ידי אוניברסיטת קנטקי, החוג לביולוגיה, משרד לימודי הסמכה ו במכללה לאמנויות ומדעים.

חומרים

  1. סרטן הנהרות (Procambarus כלארקיי). Atchafalaya ביולוגית אספקת ושות, Raceland, לוס אנג'לס., ארה"ב.
  2. תקן סרטנים מלוחים:
    • השתנה מפתרון של ואן Harreveld (1936). (מ"מ) 205 NaCl, KCl 5.3, 13.5 CaCl 2 2H 2 O, 2.45 MgCl 2 6 שעות 2 O; 5 HEPES והותאמו pH 7.4
  3. Dissection כלים: פיין # 5 פינצטה, מספריים בסדר, בעל להב סכין, # 26002-20 סיכות חרקים (להשיג כל כלי מן המדע פיין (ארה"ב), Inc, 373-G Vintage פארק דרייב, פוסטר סיטי, קליפורניה 94404-1139)
  4. צלחת Sylgard לנתיחה מצופה, צלחת ההקלטה נבנו גם עם אלקטרודה יניקה או להשתמש אלקטרודה יניקה מניפולטור מאבק להחזיק אלקטרודה יניקה.
  5. הביתור מיקרוסקופ עם פונקציית הזום הקלטות תאיים. להקלטת מוקדי על מסופי דמיינו מיקרוסקופ תרכובת עם מטרות זקוף (4 x ו-20X) משמש. אחד צריך מקור אור כספית.
  6. מגבר תאיים Standard ו-A / D הלוח על קו ההקלטה למחשב. אותות חשמל נרשמות על הקו לממשק PowerLab/4s (ADInstruments, אוסטרליה). אנו משתמשים בתוכנה מבית תקן ADInstruments בשם תרשים או היקף.
  7. כימיקלים:
    • אנו משתמשים צבע פלואורסצנטי חיוני, 4 [4 (diethylamino) styryl] N methylpyridinium יודיד (4 Di 2-ASP, בדיקות מולקולריות, יוג'ין, OR), כדי להמחיש את ורידים (Marigassi et al, 1987;. Cooper et al, 1995a. ). כימיקלים כל מלוחים התקבלו Sigma כימיים החברה (סנט לואיס, מיזורי).
  8. עבור הקלטות תאיים אנו משתמשים בצינור זכוכית נימי (קטלוג # 30-31-0 מתוך fhc, ברונסוויק, ME, 04011, ארה"ב) עבור אלקטרודות macropatch מוקד אנו משתמשים Kimax-51, לאמנות קימבל מוצרים. מס '34502, מזהה 0.8-1.1mm, 100 מ"מ אורך. אלקטרודה תאיים צריך התנגדות של mOhm 20-30. אלקטרודה macropatch נבנה על ידי ניתוק קצה הכוס לאחר טיפ יפה היה עשוי חולץ אלקטרודה. קצה שבור את צריכה להיות הפסקה בניצב נקי על 20μM בקוטר. קצה הוא חום אז מלוטש לקוטר 10μM על הפנימי. פיר של האלקטרודה פועלת אז על גוף חימום כדי לגרום לו להתכופף על 45 מעלות עם עיקול הדרגתי. זה מייצר לומן אלקטרודה שטוח או בניצב לאורך הטרמינל עצב כמו זווית עם מניפולטור מיקרו יהיה לייצר עוד כ 45 מעלות ההכנה.

מקורות

  1. Atwood, H. L. Organization and synaptic physiology of crustacean neuromuscular systems. Prog. Neurobiol. 7, 291-391 (1976).
  2. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Synaptic diversity and differentiation: Crustacean neuromuscular junctions. Invertebrate Neuroscience. 1, 291-307 (1996).
  3. Bradacs, H., Cooper, R. L., Msghina, M., Atwood, H. L. Differential physiology and morphology of phasic and tonic motor axons in a crayfish limb extensor muscle. J. Exp. Biol. 200, 677-691 (1997).
  4. Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus. J. Neurosci Methods. 61, 67-78 (1995).
  5. Cooper, R. L., Donmezer, A., Shearer, J. Intrinsic differences in sensitivity to 5-HT between high- and low-output terminals innervating the same target. Neuroscience Research. 45, 163-172 (2003).
  6. Cooper, A. S., Cooper, R. L. Historical view and demonstration of physiology at the NMJ at the crayfish opener muscle. J Vis Exp. , (2009).
  7. Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. J. Physiol. 124, 560-573 (1954).
  8. Desai-Shah, M., Viele, K., Sparks, G., Nadolski, J., Hayden, B., Srinivasan, V. K., Cooper, R. L. Assessment of synaptic function during short-term facilitation in motor nerve terminals in the crayfish. The Open Neuroscience Journal. 2, 24-35 (2008).
  9. Desai-Shah, M., Cooper, R. L. Different mechanisms of Ca2+ regulation that influence synaptic transmission: Comparison between crayfish and Drosophila neuromuscular junctions. SYNAPSE. 63, 1100-1121 (2009).
  10. Dudel, J. The effect of reduced calcium on quantal unit at the crayfish neuromuscular junction. Pfl gers Arch. 391, 35-40 (1981).
  11. Griffis, B., Moffett, S., Cooper, R. L. Muscle phenotype remains unaltered after limb autotomy and unloading. J. Exp. Zool. 289, 10-22 (2001).
  12. Harata, N., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Mozhayeva, M., Kavalai, E. T., Tsien, R. W. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends in Neurosci. 24, 637-643 (2001).
  13. Jeromin, A., Shayan, A. J., Msghina, M., Roder, J., Atwood, H. L. Crustacean frequenins: molecular cloning and differential localization at neuromuscular junctions. J. Neurobiol. 41 (2), 165-175 (1999).
  14. Johnstone, A. F. M., Kellie, S., Cooper, R. L. Presynaptic depression in phasic motor nerve terminals and influence of 5-HT on docked vesicles. The Open Neuroscience Journal. 2, 16-23 (2008).
  15. Katz, B., Kuffler, S. W. Excitation of the nerve-muscle system in Crustacea. Proc. Roy. Soc. B. 133, 374-389 (1946).
  16. Kennedy, D., Takeda, K. Reflex control of abdominal flexor muscles in crayfish. I. The twitch system. J. Exp. Biol. 43, 211-227 (1965).
  17. Kennedy, D., Takeda, K. Reflex control of abdominal flexor muscles in crayfish. II. The tonic system. J. Exp. Biol. 43, 229-246 (1965).
  18. King, M. J. R., Atwood, H. L., Govind, C. K. Structural features of crayfish phasic and tonic neuromuscular junctions. J. Comp. Neurol. 372, 618-626 (1996).
  19. LaFramboise, W., Griffis, B., Bonner, P., Warren, W., Scalise, D., Guthrie, R. D., Cooper, R. L. Muscle type specific myosin isoforms in crustacean muscles. J. Exp. Zool. 286, 36-48 (2000).
  20. Logsdon, S., Johnstone, A. F. M., Viele, K., Cooper, R. L. Regulation of synaptic vesicles pools within motor nerve terminals during short-term facilitation and neuromodulation. J. Applied Physiol. 100, 662-671 (2006).
  21. Lucas, K. The analysis of complex excitable tissues by their response to electric currents of short duration. J. Physiol. 35, 310-331 (1907).
  22. Lucas, K. On summation of propagated disturbances in the claw of Astacus and on the double neuromuscular system of the abductor. J. Physiol. 51, 1-35 (1917).
  23. Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J. Neurosci. 7, 1207-1214 (1987).
  24. Millar, A. G., Bradacs, H., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Inverse relationship between release probability and readily releasable vesicles in depressing and facilitating synapses. J. Neurosci. 22, 9661-9667 (2002).
  25. Millar, A. G., Zucker, R. S., Ellis-Davies, C. G., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Calcium sensitivity of neurotransmitter release differs at phasic and tonic synapses. J. Neurosci. 25, 3113-3125 (2005).
  26. Msghina, M., Govind, C. K., Atwood, H. L. Synaptic structure and transmitter release in crustacean phasic and tonic motor neurons. J. Neurosci. 18, 1374-1382 (1998).
  27. Msghina, M., Millar, A. G., Charlton, M. P., Govind, C. K., Atwood, H. L. Calcium entry related to active zones and differences in transmitter release at phasic and tonic synapses. J. Neurosci. 19, 8419-8434 (1999).
  28. Mykles, D. L., Medler, S. A., Koenders, A., Cooper, R. L. Myofibrillar protein isoform expression is correlated with synaptic efficacy in slow fibres of the claw and leg opener muscles of crayfish and. 205 (4), 513-522 (2002).
  29. Sparks, G., Cooper, R. L. 5-HT offsets homeostasis of synaptic transmission during short-term facilitation. J. Applied Physiol. 96, 1681-1690 (2004).
  30. Sohn, J., Mykles, D. L., Cooper, R. L. The anatomical, physiological and biochemical characterization of muscles associated with the articulating membrane in the dorsal surface of the crayfish abdomen. J. Exp. Zool. 287, 353-377 (2004).
  31. Tsien, R. W., Harata, N. C., Choi, S. W. P. y. l. e., Aravanis, A. M., AM, G. C. h. e. n. Vesicles, quanta and synaptic plasticity. Molecular Mechanisms of synaptic function. , (2001).
  32. Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustaceans. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34, 428-432 (1936).
  33. Van Harreveld, A., Wiersma, C. A. G. The triple innervation of the crayfish muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 22, 667-667 (1936).
  34. Wiersma, C. A. G., Van Harreveld, A. The influence of the frequency of stimulation on the slow and fast contraction in crustacean muscle. Physiol. Zool. 11, 75-81 (1938).
  35. Wojtowicz, J. M., Smith, B. R., Atwood, H. L. Activity-dependent recruitment of silent synapses. Ann. N.Y. Acad. Sci. 627, 169-179 (1991).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Focal MacropatchEPSP

מאמרים קשורים