$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
הכנה של ריאגנטים
הכינו מלאי איזוטוני percoll (SIP), 4 מ"ל לכל המוח, על ידי ערבוב 9 חלקים percoll עם חלק אחד של 10X HBSS ללא Ca + + ו - Mg + +.
הכן SIP ב 70% 1X HBSS ללא Ca + + ו - Mg + +, 2 מ"ל לכל המוח לוותר לתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל חרוטי.
הערה: מומלץ percoll יש להשתמש בטמפרטורת החדר, אם משתמשים בו קר, תאים נוטים גוש והפרדה התא הוא פחות יעיל.
רקמות איסוף homogenization
הרדימי עכברים perfuse דרך החדר השמאלי עם קרים כקרח HBSS 1X. לנתח את המוח ואת חוט השדרה ולשמור על RPMI ללא פנול אדום עד שכל העכברים מוקרבים.
רקמות מקום 7 או 15 מ"ל dounce homogenizer המכיל 3 מ"ל של RPMI, בעדינות לעשות השעיה תא עם העלי רפויים (גודל) ואחריו העלי Tigh צמודה (גודל ב ') כדי להמשיך לנתק את הרקמות. השלם את נפח של המתלים התא מ"ל 7 עם RPMI.
צבע להגדיר
הוסף 3 מ"ל של SIP כדי השעיית התא לבצע SIP 30% הסופי
לאט לאט שכבת ההשעיה תא 10 מ"ל על גבי SIP 70%. זהו השלב הקריטי ביותר של ההליך, השתמש פיפטה, סיוע להגדיר במצב כבידה למנוע ערבוב של 70% ו 30% פתרונות. קו שטוח מאוד ברור צריך להיות גלוי בצומת 70% -30%.
צנטריפוגה 30 דקות ב 500 גרם 18 ° C. ודא צנטריפוגות יפסיקו עם בלם מינימלית או לא, כך שלבי הביניים אינה מופרעת.
שימוש pipet העברה, בעדינות להסיר את השכבה של פסולת מהחלק העליון של הצינור ולאסוף 2.0-3.0 מ"ל של שלבי הביניים 70% -30% לתוך צינור חרוטי נקי המכיל 8 מ"ל של 1X HBSS. ודא percoll המכיל את שלבי הביניים הוא מדולל על פי שלוש, לערבב כמה פעמים על ידי היפוך centrifugre ו 7 דקות ב 500 גרם ב 18 ° C.
Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של חיץ מכתים תא ולהעביר אותו צינור 1.5 מ"ל לשטוף עוד פעם אחת באמצעות צנטריפוגות מיקרו ב 10,000 G 1 דקות ב 4 ° C.
נוגדן מכתים
כדורי Resuspend ב 50 μl של מטוהרים antimouse CD16/CD32 מדולל 1:200 במאגר מכתים התא כדי לחסום את אתרי הקישור Fc. לדגור על קרח למשך 10 דקות. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
הוסף 50 μl של שילוב נוגדן קוקטייל לדגור על קרח למשך 30 דקות. נוגדן כל חייב להיות טיטרציה הראשון להעריך דילול אופטימלי. השתמש שילובים fluorochrome המתאים נבחר על פי היכולות של לייזר הגדרות המסנן של cytometer תזרים הספציפית שלך.
שטפו תאים חיץ תא מכתים, כדורי resuspend ב μl 100-200 של חיץ מכתים תא ולנתח מיד cytometer, או לחילופין תאים ניתן resuspended paraformaldehyde ב 2% (PFA) שהוכנו PBS ומאוחסנים יתר בלילה 4 ° C .
נציג תוצאות:
אחרי סיבוב הדרגתיים, את שלבי הביניים 70% -30% צריך הילה לבנה מוגדר, quantitation של תאים התאושש עכבר תמים צריך להניב 3-5 x10 5 תאים לכל עכבר (המוח וחוט השדרה ועוד). דלקת המוח אולי החל מספרים של תאים דלקתיים בהתאם העלבון CNS או מודל המחלה (איור 1).
באיור 1. בידוד של תאים mononuclear, מן תמים EAE מוח על המחלה שיא. תאים השעיות המוח הופרדו על רציפות 70% / 30% percoll הדרגתיים. מוכתם תאים הודגרו עם FC-לחסום ואחריו אנטי CD45 נוגדנים למשך 30 דקות על הקרח. תאים שהיו שטופים במאגר מכתים התא קבוע ברכישת PFA 2% מוקדם LSR-II. CD45 העוצמה נמדדת על ציר Y, כאשר שלוש האוכלוסיות ברורים הם דמיינו. אפיון נוסף של פנוטיפ החיסונית של CD45 בתאי היי חדירה מיושמת באמצעות נוגדנים נוספים ונותחו לאחר מכן על ידי cytometry הזרימה.