הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Transfection ו mutagenesis של גני מטרה של תאים על ידי יתוש נעול חומצה שונה oligonucleotides גרעין

9.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/2355

⸱

26 בדצמבר 2010

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, University of California, Davis, 2Département Génétique et Développement, Institut Cochin, Université Paris Descartes

במאמר זה

סיכום

Oligonucleotides ניתן להשתמש כדי לאתר ספציפי תחליף נוקלאוטיד בודד של גני מטרה transfected בשני אנופלס gambiae ו אנופלס stephensi תאים.

תקציר

טפילים Plasmodium, הסוכן סיבתי של מלריה, המועברות דרך עקיצות של יתושים נגועים אנופלס וכתוצאה מכך יותר מ -250 מיליון זיהומים חדשים בכל שנה. למרות עשורים של מחקר, אין עדיין חיסון נגד מלריה, המדגישה את הצורך של אסטרטגיות שליטה רומן. גישה אחת היא השימוש החדשני של יתושים מהונדסים גנטית כדי לשלוט ביעילות טפיל המלריה הילוכים. שינויים מכוונת של המסלולים התא איתות היתוש, דרך mutagenesis ממוקד, נמצאו להסדיר טפיל הפיתוח 1. מתוך מחקרים אלה, אנו יכולים להתחיל לזהות מטרות הגן פוטנציאל לשינוי. Mutagenesis ממוקד הסתמכה באופן מסורתי על רקומבינציה הומולוגיים בין גן המטרה מולקולת דנ"א גדולים. עם זאת, הבנייה והשימוש כגון מולקולות דנ"א מורכבות עבור הדור של שורות תאים הפך ביציבות הוא זמן יקר, רב יעיל לעתים קרובות. לכן, האסטרטגיה באמצעות נעול גרעין חומצה שונה oligonucleotides (LNA לפיירפוקס) מספק אלטרנטיבה יעילה מציגה תחליפים מלאכותיים נוקלאוטיד בודד לתוך episomal ו כרומוזומליות הגן מטרות DNA (הנסקרת ב 2). LNA-ON בתיווך mutagenesis ממוקד נעשה שימוש כדי להציג את נקודת מוטציות בגנים עניין של תאים בתרבית שמרים והן בעכברים 3,4. אנחנו מראים כאן LNA-RSS יכול לשמש כדי להציג שינוי של נוקלאוטיד יחיד מטרה episomal transfected כי התוצאות מתג מכחול ביטוי חלבון פלואורסצנטי (BFP) לירוק ביטוי פלורסנט חלבון (GFP) הן gambiae אנופלס ו אנופלס תאים stephensi . המרה זו ממחישה בפעם הראשונה כי mutagenesis יעיל של גני מטרה בתאים יתוש יכולה להיות מתווכת על ידי LNA תוספות ומציע כי טכניקה זו עשויה להיות ישימה mutagenesis מטרות כרומוזומליות במבחנה in vivo.

פרוטוקול

  1. לפני תחילת הפרוטוקול, חשוב כדי לקבוע כי התאים יתוש השתמשו בניסוי בריאים בנקודת המפגש ~ 80% אם חסיד (איור 1). התאים מגודלים או לא בריא תגרום יעילות transfection נמוך ייתן תוצאות לא עקביות.
  2. חימום בכל אמצעי התקשורת לפני שימוש באמבט מים C ° 28 במשך 30 דקות.
    1. א stephensi MSQ43 תאים דורשים E5 בינוני: ממ, של ארל w / גלוטמין, חום FCS מומת 5%, 0.2% D-גלוקוז, 1% פניצילין, האנטיביוטיקה סטרפטומיצין, ו -1% שאינם חיוניים חומצות אמינו.
    2. א gambiae תאים SUA5B דורשים בינוני S2: תסיסנית שניידר בינוני, חום FCS מומת 5% ו -1% פניצילין, האנטיביוטיקה סטרפטומיצין
  3. הפשירי ולאחסן כל מגיב transfection חומרים, פלסמידים, ו oligonucleotides על הקרח.
  4. כל הנהלים צריכים להתבצע במנדף תרבות רקמות באמצעות טכניקה סטרילית.
  5. עבור תאים חסיד (א gambiae SUA5B, א stephensi MSQ43) לשאוב את התקשורת הישנים מבלי להפריע את התאים, להוסיף נפח המקבילה של התקשורת טרי כי כבר חימם עד 28 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף את התאים מלמטה של הבקבוק באמצעות פיפטה.
  6. ריכוז של תאים צריך להיקבע תוך התאמה ריכוז סופי של 1x10 6 תאים / מ"ל. תאים יכולים להישמר בטמפרטורת החדר בעת הכנת חומרי מגיב transfection.
  7. הוסף 1 מ"ל של תאים יתוש (1x10 6 תאים / מ"ל) היטב בכל צלחת 6 באר. הגדרת צלחת עבור כל תנאי הניסוי (ראה להלן).
    לוח ט היא ערכת pipetting עבור transfection כללית. טבלה II מתאר חמישה תנאים כדי לבדוק mutagenesis מוצלח של נוקלאוטיד יחיד באמצעות BFP ספציפי LNA-RSS. שני הראשונים, ואת pGFP pBFP, הן בקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה. הנותרים הם תנאי הניסוי של pBFPs עם ריכוז גדל והולך של BFP ספציפי LNA-RSS. בשנת צעדים 8 עד 12, להוסיף כמויות מתאימות של מגיב בהתאם לכל מצב.
  8. העברת פלסמיד דנ"א כדי צינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל ולהוסיף נפח מתאים של חיץ EC.
    1. עבור 1 פלסמיד דנ"א μL (1 מיקרוגרם / μL), להוסיף 99 μL של חיץ EC.
    2. עבור pGFP 1 μL (1μg / μL), להוסיף 99 μL של חיץ EC.
    3. עבור pBFP 1 μL (1μg / μL), להוסיף 99 μL של חיץ EC.
    4. עבור pBFP 1 μL (1μg / μL) ו 1 μL ON (מיקרוגרם / μL), להוסיף 98 μL של חיץ EC.
    5. עבור pBFP 1 μL (1μg / μL) ו 5 μL ON (1μg / μL), להוסיף 94 μL של חיץ EC.
    6. עבור pBFP 1 μL (1μg / μL) ו 10 μL ON (1μg / μL), להוסיף 89 μL של חיץ EC.
  9. ואז לאט לאט להוסיף Enhancer לכל 1 מיקרוגרם של ה-DNA בשימוש.
    1. עבור 1 פלסמיד דנ"א μL, להוסיף 8 Enhancer μL.
    2. עבור pGFP 1 μL, להוסיף 8 Enhancer μL.
    3. עבור pBFP 1 μL, להוסיף 8 Enhancer μL.
    4. עבור pBFP 1 μL ו 1 μL ON, להוסיף 16 Enhancer μL.
    5. עבור pBFP 1 μL ו 5 μL ON, להוסיף 48 Enhancer μL.
    6. עבור pBFP 1 μL ו 10 μL ON, להוסיף 88 Enhancer μL.
  10. וורטקס DNA / חיץ / Enhancer התערובת במשך 1 sec ולוודא את כל הפתרון הוא בתחתית של התחתית. ואז דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  11. הוסף מגיב Effectene לכל DNA 1 מיקרוגרם מערבולת פלסמיד עבור 10 שניות. ודא כי כל הפתרון הוא בתחתית של התחתית ואז דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    1. עבור 1 פלסמיד דנ"א μL, להוסיף 10 Effectene μL (טבלה I).
    2. עבור pGFP 1 μL, להוסיף 10 Effectene μL (טבלה II).
    3. עבור pBFP 1 μL, להוסיף 10 Effectene μL (טבלה II).
    4. עבור pBFP 1 μL ו 1 μL ON, להוסיף 20 Effectene μL (טבלה II).
    5. עבור pBFP 1 μL ו 5 μL ON, להוסיף 60 Effectene μL (טבלה II).
    6. עבור pBFP 1 μL ו 10 μL ON, להוסיף 110 Effectene μL (טבלה II).
  12. תביאו כל צינור לנפח הסופי של μL 1000 על ידי הוספת התקשורת חיממה dropwise לתערובת הדנ"א / חיץ / Enhancer / Effectene. ה-DNA עשויה לזרז בשלב זה אם התקשורת היא הוסיפה מהר מדי. לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
    1. עבור 1 פלסמיד דנ"א μL, להוסיף מדיה 882 μL (טבלה I).
    2. עבור pGFP 1 μL, להוסיף מדיה 882 μL (טבלה II).
    3. עבור pBFP 1 μL, להוסיף מדיה 882 μL (טבלה II).
    4. עבור pBFP 1 μL ו 1 μL ON, להוסיף 864 μL התקשורת (טבלה II).
    5. עבור pBFP 1 μL ו 5 μL ON, להוסיף 792 μL התקשורת (טבלה II).
    6. עבור pBFP 1 μL ו 10 μL ON, להוסיף מדיה 702 μL (טבלה II).
  13. הבא לאט להוסיף 1 מ"ל של תערובת ה-DNA / Enhancer / Effectene מתאים לכל אחד גם טיפה בכל פעם.
  14. מערבולת הצלחת בעדינות כדי להבטיח התפלגות אחידה של תאים תערובת transfection. Incubatדואר התאים בתנאים צמיחה נורמלית.
  15. יום אחד לאחר transfection, לשאוב בעדינות את המדיה לאט להחליף עם נפח שווה ערך של התקשורת חיממה טרי. חשוב לא להפריע את שכבות התאים בחלק התחתון של בארות המים בעת ביצוע פעולה זו.
  16. יומיים לאחר transfection לבחון תאים בקרה חיובית transfected עם pGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע יעילות transfection (איור 2).
  17. תאים SUA5B לגדול מהר מאוד יהפכו מגודל. ארבעה ימים לאחר דקה transfection תאים אלה על ידי aspirating את התקשורת הישנה והוספת לאט נפח המקבילה של התקשורת חיממה טרי.
  18. לאחר הוספת המדיה החדשה של בארות, לנתק כל התאים מתחתית היטב על ידי כל pipeting למעלה ולמטה, לזרוק חצי נפח (1 מ"ל) של התערובת בתא ולהוסיף 1 מ"ל של התקשורת חיממה טריים להביא את הכרך האחרון 2 מ"ל.
  19. בדוק תאים יומי כדי לוודא שהם בריאים ולא מגודל, דקה לפי הצורך.
  20. אפשר התאים לגדול בתנאים רגילים עבור transfection ימים 06:55 הודעה לפני לאסוף אותם לניתוח.
  21. בשלב transfection ימים 5-7 לפרסם, לאסוף את התאים על ידי aspirating את התקשורת הישנה בכל הבארות והוספת 1 מ"ל סטרילי בטמפרטורת החדר PBS היטב כל אחד.
  22. ניתוק תאים מתחתית היטב על ידי pipetting מעלה ומטה העברת תערובת התא 5 הצמד צינורות מ"ל כובע ומיד לנתח תאים באמצעות cytometry הזרימה.

נציג תוצאות

איור 1
איור 1 א. בריא Untransfected stephensi MSQ43 (A) וא ' gambiae SUA5B (ב) תאים בנקודת המפגש כ -80%.

איור 2
איור 2 א. stephensi MSQ43 (A) וא ' gambiae SUA5B (ב) תאים transfected עם GFP בקרה חיובית לבטא פלסמיד.

איור 3
איור 3. Cytometry זרימת נתונים המאשר ההמרה של BFP ל-GFP דרך mutagenesis transfection של נוקלאוטיד יחיד הבאים עם BFP ספציפי נעול גרעין חומצה שונה oligonucleotides (LNA-RSS). תאים SUA5B היו transfected עם GFP להביע פלסמיד (pGFP) כביקורת חיובית, עם BFP להביע פלסמיד (pBFP) כביקורת שלילית, או עם pBFP ריכוזי הגוברת של BFP ספציפי LNA לפיירפוקס. (א) gating אסטרטגיה cytometry זרימת הנתונים מראה משמאל לימין: פיזור קדימה לעומת הצד של תאים חיים, יודיד propidium (PI) תאים שלילי, ותאי ה-GFP חיובית בחמשת הימים הבאים transfection. (ב) גרף של אחוז התאים ה-GFP חיובי שמוצג transfection (א) הבא עם pBFP ריכוזי הגוברת של LNA-RSS.

טבלה 1
לוח ט התנאים transfection.

טבלה 2
טבלה II. Transfection תנאי שימוש באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מציגים שיטה במבחנה ראיות המרה ממוקד של נוקלאוטיד יחיד יעד הגן episomal הבאים transfection של LNA לפיירפוקס לתוך A. stephensi וא gambiae תאים. LNA-ON בתיווך המרה הגן דורש גיוס של אתר ספציפי בתגובה DNA תיקון: הנתונים שלנו מצביעים על כך התאים יתוש יכול לתמוך זה מנגנון mutagenesis אתר ספציפי. בעוד השיטה המוצגת כאן מבוססת על המרה של יעד episomal, הנתונים שלנו מצביעים על כך LNA-ON בתיווך ההמרה יכול להיות מותאם עבור מטרות כרומוזומליות בתאים יתוש כפי שהיה במערכות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

ברצוננו להודות אבי ספינר במרכז הלאומי לחקר פרימטים קליפורניה לסיוע שלה עם cytometry הזרימה. מחקר זה נתמך על ידי מימון מן המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) AI073745, AI080799 ו AI078183.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ריאגנט טרנספקציה EffecteneQiagen301425
פלסמיד בקרת GFP‏ (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)InvitrogenK4935-00
פלסמיד BFP (pcDNA5/FRT/TO)מתנה מד"ר Concordet3
LNA-ONs מתנה מד"ר Concordet3
MEM, Earle’עם גלוטמיןInvitrogen11095
סרום עגל עוברי (FCS)Invitrogen16000
שנידר’אנא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם. <מיקרוסקופיה אלקטרונית בשימור (EM)>דרוזופילה מצעInvitrogen11730
חומצות אמינו שאינן חיוניותInvitrogen11140
10% D-גלוקוזSigma-AldrichG5767
אנטיביוטיקה של פניצילין-סטרפטומיציןInvitrogen15140
פלטות תרבית בעלות 6 בארותCorning3516

מקורות

  1. Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
  2. Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
  3. Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
  4. Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
  5. Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
  6. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
  7. Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
  8. Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
  9. Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
  10. Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אוליגונוקלאוטידים של חומצת גרעין נעולה (LNA)מוטגנזה מכוונת לאתרטרנספקציה של תאי יתושביטוי של חלבון פלואורסצנטיאנליזה בציטומטריית זרימהתגית גנים אפיזומליתתאי Anopheles gambiaeהמרה של BFP ל-GFPהכנת ריאגנט לטרנספקציהניטור צפיפות תאים
Transfection ו mutagenesis של גני מטרה של תאים על ידי יתוש נעול חומצה שונה oligonucleotides גרעין
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.