Oligonucleotides ניתן להשתמש כדי לאתר ספציפי תחליף נוקלאוטיד בודד של גני מטרה transfected בשני אנופלס gambiae ו אנופלס stephensi תאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Transfection ו mutagenesis של גני מטרה של תאים על ידי יתוש נעול חומצה שונה oligonucleotides גרעין
במאמר זה
סיכום
תקציר
טפילים Plasmodium, הסוכן סיבתי של מלריה, המועברות דרך עקיצות של יתושים נגועים אנופלס וכתוצאה מכך יותר מ -250 מיליון זיהומים חדשים בכל שנה. למרות עשורים של מחקר, אין עדיין חיסון נגד מלריה, המדגישה את הצורך של אסטרטגיות שליטה רומן. גישה אחת היא השימוש החדשני של יתושים מהונדסים גנטית כדי לשלוט ביעילות טפיל המלריה הילוכים. שינויים מכוונת של המסלולים התא איתות היתוש, דרך mutagenesis ממוקד, נמצאו להסדיר טפיל הפיתוח 1. מתוך מחקרים אלה, אנו יכולים להתחיל לזהות מטרות הגן פוטנציאל לשינוי. Mutagenesis ממוקד הסתמכה באופן מסורתי על רקומבינציה הומולוגיים בין גן המטרה מולקולת דנ"א גדולים. עם זאת, הבנייה והשימוש כגון מולקולות דנ"א מורכבות עבור הדור של שורות תאים הפך ביציבות הוא זמן יקר, רב יעיל לעתים קרובות. לכן, האסטרטגיה באמצעות נעול גרעין חומצה שונה oligonucleotides (LNA לפיירפוקס) מספק אלטרנטיבה יעילה מציגה תחליפים מלאכותיים נוקלאוטיד בודד לתוך episomal ו כרומוזומליות הגן מטרות DNA (הנסקרת ב 2). LNA-ON בתיווך mutagenesis ממוקד נעשה שימוש כדי להציג את נקודת מוטציות בגנים עניין של תאים בתרבית שמרים והן בעכברים 3,4. אנחנו מראים כאן LNA-RSS יכול לשמש כדי להציג שינוי של נוקלאוטיד יחיד מטרה episomal transfected כי התוצאות מתג מכחול ביטוי חלבון פלואורסצנטי (BFP) לירוק ביטוי פלורסנט חלבון (GFP) הן gambiae אנופלס ו אנופלס תאים stephensi . המרה זו ממחישה בפעם הראשונה כי mutagenesis יעיל של גני מטרה בתאים יתוש יכולה להיות מתווכת על ידי LNA תוספות ומציע כי טכניקה זו עשויה להיות ישימה mutagenesis מטרות כרומוזומליות במבחנה in vivo.
פרוטוקול
- לפני תחילת הפרוטוקול, חשוב כדי לקבוע כי התאים יתוש השתמשו בניסוי בריאים בנקודת המפגש ~ 80% אם חסיד (איור 1). התאים מגודלים או לא בריא תגרום יעילות transfection נמוך ייתן תוצאות לא עקביות.
- חימום בכל אמצעי התקשורת לפני שימוש באמבט מים C ° 28 במשך 30 דקות.
- א stephensi MSQ43 תאים דורשים E5 בינוני: ממ, של ארל w / גלוטמין, חום FCS מומת 5%, 0.2% D-גלוקוז, 1% פניצילין, האנטיביוטיקה סטרפטומיצין, ו -1% שאינם חיוניים חומצות אמינו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן אנו מציגים שיטה במבחנה ראיות המרה ממוקד של נוקלאוטיד יחיד יעד הגן episomal הבאים transfection של LNA לפיירפוקס לתוך A. stephensi וא gambiae תאים. LNA-ON בתיווך המרה הגן דורש גיוס של אתר ספציפי בתגובה DNA תיקון: הנתונים שלנו מצביעים על כך התאים יתוש יכול לתמוך זה מנגנון mutagenesis אתר ספציפי. בעוד השיטה המוצגת כאן מבוססת על המרה של יעד episomal, הנתונים שלנו מצביעים על כך LNA-ON בתיווך ההמרה יכול להיות מותאם עבור מטרות כרומוזומליות בתאים יתוש כפי שהיה במערכות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
ברצוננו להודות אבי ספינר במרכז הלאומי לחקר פרימטים קליפורניה לסיוע שלה עם cytometry הזרימה. מחקר זה נתמך על ידי מימון מן המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) AI073745, AI080799 ו AI078183.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ריאגנט טרנספקציה Effectene | Qiagen | 301425 | |
| פלסמיד בקרת GFP (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| פלסמיד BFP (pcDNA5/FRT/TO) | מתנה מד"ר Concordet3 | ||
| LNA-ONs | מתנה מד"ר Concordet3 | ||
| MEM, Earle’עם גלוטמין | Invitrogen | 11095 | |
| סרום עגל עוברי (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| שנידר’אנא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם. <מיקרוסקופיה אלקטרונית בשימור (EM)>דרוזופילה מצע | Invitrogen | 11730 | |
| חומצות אמינו שאינן חיוניות | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-גלוקוז | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| אנטיביוטיקה של פניצילין-סטרפטומיצין | Invitrogen | 15140 | |
| פלטות תרבית בעלות 6 בארות | Corning | 3516 |
מקורות
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
