Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לנתח, transfect דרך electroporation ועכבר תרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח. לטווח קצר תרבויות ניתן להשתמש ללימודי תולדה של האקסון והדרכה, ואילו לטווח ארוך תרבויות יכול לשמש מחקרים synaptogenesis ניתוח בעמוד השדרה הדנדריטים.

תקציר

נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד את מערכת העצבים המרכזית (CNS) קיטוב העצבית, האקסון / דנדריט תוצאה, היווצרות הסינפסה ותפקוד. היתרון של נוירונים אלה culturing היא שהם בקלות לקטב, להרכיב אקסונים הייחודי דנדריטים, על מצע דו מימדי בצפיפויות נמוכות מאוד. תכונה זו הפכה אותם מאוד שימושי לקביעת היבטים רבים של ההתפתחות העצבית. יתר על כן, על ידי מתן מיזוג גליה עבור הנוירונים האלה הם ימשיכו להתפתח, ויצרו קשרים סינפטיים פונקציונלי לשרוד במשך כמה חודשים בתרבות. בפרוטוקול זה אנו המתאר טכניקה לנתח, תרבות transfect נוירונים בהיפוקמפוס העכבר עובריים קליפת המוח. Transfection מושגת על ידי electroporating דנ"א לתוך הנוירונים לפני ציפוי באמצעות nucleofection. פרוטוקול זה יש את היתרון של להביע חלבונים היתוך fluorescently-tagged מוקדם בהתפתחות (~ 4-8hrs לאחר ציפוי) כדי ללמוד את הדינמיקה ואת התפקוד של החלבונים במהלך תוצאה, האקסון הקיטוב הסתעפות. גילינו גם כי זה transfection יחיד לפני ציפוי שומרת fluorescently-tagged חלבון ביטוי היתוך ברמות המתאימות הדמיה במהלך חייו של נוירון (> 2 חודשים בתרבות). לפיכך, מתודולוגיה זו שימושית ללימוד לוקליזציה חלבון ותפקוד בכל התפתחות מערכת העצבים המרכזית, עם הפרעה קטנה או לא של תפקוד עצבי.

פרוטוקול

1. הכנת Coverslips ו צ'יימברס

1. הכנת coverslips ותאי נקי חיונית תרבויות בריא. קיצורי דרך לא צריך לקחת את כל הצעדים האלה.
2. שטפו את coverslips (עגול 12mm או 22mm, זכוכית הגרמנית - מותג קרוליינה עוזר) לילה חומצה חנקתית מרוכזת (HNO3) בצנצנת זכוכית או כוס ייעודי.
3. הסר את coverslips של חומצה חנקתית ולשטוף בהרחבה (5-7x) במים deionized.
4. הפרד את coverslips ויבש במנדף זרימה למינרית או ארון biosafety. כאשר יבש, לעקר אותם עם אור UV במשך 30 דקות. המקום מעוקרים coverslips לתוך מנות פטרי סטרילית לאחסון. אם הנוירונים ציפוי על coverslips 12mm ישירות למקום coverslips בצלחת 35mm סטרילית ולהמשיך סעיף 2.
5. חדרי הדמיה בנויים על ידי קידוח חור 15mm בתחתית של מנות 35mm פטרי (להסיר את כל הקוצים) ו הצמדת coverslips לנקות בתערובת 03:01 של פרפין וזלין.
6. ממיסים את פרפין / תערובת וזלין בתוך צינור חרוטי בתוך אמבט מים רותחים. השתמשו במברשת צבע קטנה מעיל התחתון של המנה סביב החור 15mm. הקפד לשמור על ערבוב פרפין / תערובת וזלין כפי שהוא יהיה נפרד. בדרך כלל זה גורם לתאי מודבק יחד עם ריכוז גבוה של וזלין, אשר תהפוך צמיגה כאשר המנות ממוקמות בתוך האינקובטור, וכתוצאה מכך ניתוק coverslip. פרפין הנותרים / וזלין ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר.
7. מניחים את צלחת הפוכה על מגש שטוח המקום coverslip מעל החור. מחממים תנור 80 ° C עד שהתערובת פרפין הוא נמס (~ 10 דקות). הסר הכלים על גבי משטח שטוח ולתת להגדיר תערובת פרפין.
8. הפעל את הכלים שוב לעקר הן הפנימי של מכסה בתחתית לתאי עם האור האולטרה סגול.
9. מעיל coverslips או אזורים כוס לתאי עם 1.0mg/mL Poly-d-ליזין (30kDa) ב borate חיץ (borate 0.1M נתרן, pH 8.5) למשך שעה אחת. יש לשטוף 3-5 פעמים עם כמויות של מים תרבות כיתה רקמות deionized. הקפד להסיר כל עקבות של חיץ borate. יבש ולהשתמש מיד או לאחסן בתאי / coverslips לשימוש מאוחר יותר. אנחנו בדרך כלל להשתמש coverslips לנקות בתוך חודש אחד של הכנה.

2. הכנת Dissection העצבית ובינוניים תרבות

1. הכן את המדיום דיסקציה (DM) על ידי הוספת כמויות מתאימות של HBSS 10x ו HEPES 100x למים בתרבית רקמה כיתה. חנות ב 4 ° C. שמור על הקרח במהלך הניתוח.
2. יום לפני לנתיחה מכינים את ציפוי בינוני (PM) ו - סרום ללא בינוני (SFM). PM מורכב בינוני Neurobasal, תוסף B27, גלוטמין 2 מ"מ, גלוקוז 0.3%, 37.5 mM NaCl ו - 5% בסרום שור העובר (FBS). SFM מורכב בינוני Neurobasal, תוסף B27, גלוטמין 2 מ"מ, גלוקוז 0.3% ו 37.5 mM NaCl.
3. מספיק לעשות רק לנתיחה ולאחסן בתרבות רקמה חממה לילה עם כובע פתוחה מעט, כך הטמפרטורה CO ₂ תוכן equilibrates בינוני. אנו מוסיפים גלוקוז נוסף ולהגדיל את osmolality כדי 310mOsm עם כ NaCl. אנו מוצאים התרבויות לעשות טוב יותר osmolality פיזיולוגי יותר (osmolality Neurobasal הוא בדרך כלל 205-245mOsm).

3. שכבה קליפתיים גליה מזין הכנה לטווח ארוך תרבויות

1. אם תרבויות לטווח ארוך הן כדי להיות מוכן, לבצע את החלק הזה של שבועיים עד שלושה שבועות פרוטוקול לפני שתמשיך עם חתכים או קליפת המוח בהיפוקמפוס.
2. הכן בינוני גליה (GM) עם מזכרות, גלוקוז 0.3%, פניצילין / סטרפטומיצין ו בסרום סוס 10%.
3. להרדים P1-P3 גורים העכבר על ידי קירור על הקרח במשך 5 דקות. הסר כל הגור מן הקרח תרסיס עם אתנול 70%. במהירות לערוף במספריים. הסר את המוח כולו מאכל המכיל קר DM (שלב 2.1).
4. הסר את שני חצאי המוח קרומי המוח. הניאוקורטקס והבלו ולהסיר את צלחת חדשה המכילה אין מדיה. הכן בקורטקס המוח מתוך 4 בסך הכל.
5. בשר טחון קליפת המוח עם להב, גילוח נקי סטרילי כמו קנס ככל האפשר ולהסיר רקמה קצוץ עם טפטפת פלסטיק צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 12 מ"ל של קר DM. הוספת טריפסין ו DNase לריכוזים הסופי של 0.25% (1.5 מ"ל) ו - 0.1% (1.5 מ"ל), בהתאמה. מדגירים את אמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם מתערבל לסירוגין.
6. הסר את שפופרת המכילה את רקמת קליפת המוח ולנקות ביסודיות עם אתנול 70% לפני הבאת לתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה. רקמה Pipet קליפת המוח מעלה ומטה עם טפטפת 10 מ"ל כ 10-15 פעמים, או עד שרוב נתחי להיעלם.
7. החזר את הצינור כדי 37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 10 דקות עם מתערבל לסירוגין.
8. לנקות ביסודיות את הצינור עם 70% אתנול ו להחזיר אותו למכסה המנוע בתרבית רקמה. Pipet רקמת קליפת המוח מעלה ומטה עם 5 מ 'L פיפטה כ 10-15 פעמים, או עד נתחי נעלמים.
9. הוסף 15 מ"ל של GM חם צנטריפוגות ב 200xg (1000rpm) במשך 10 דקות.
10. בטל supernatant, resuspend התאים pelleted ב 20 מ"ל של GM טריים לספור עם hemocytometer. 5-7.5x10 פלייט ⁶ תאים 15 מ"ל של GM לכל בקבוק ² 75 ס"מ.
11. אחרי יום אחד כל 2-3 ימים לאחר מכן בתרבות, לסלק תאים משוחרר על ידי דופק את הבקבוק נגד היד שלך. הסר את בינוני יחד עם כל התאים וחילצה ולהחליפו 15 מ"ל של GM טריים.
12. גליה ניתן לקצור לאחר 1-2 שבועות של צמיחה צלוחיות, כאשר הם על 70-100% ומחוברות. כדי להכין coverslips הפרט מצופה גליה, מקום 6 חומצה חנקתית ניקה מעוקרים 25mm coverslips סביב צלחת 10 ס"מ, ומקום 3 נקודות תערובת 03:01 של פרפין / וזלין על coverslip כל תבנית משולש עם מברשת צבע קטנה . פנקו את הכלים לפתוח עם אור UV במשך 30 דקות. המעיל coverslips עם 0.1 מ"ג / מ"ל ​​Poly-d-ליזין (30kDa) במאגר borate במשך שעה אחת, ולאחר מכן לשטוף בהרחבה (3-5x) עם תרבות סטרילי מים כיתה רקמות deionized ולתת להתייבש.
13. הסר את הבקבוק גליה המכילים מן האינקובטור, להשליך את המדיום ולשטוף עם 5 מ"ל של טרום חימם טריפסין / פתרון EDTA. הסר את הפתרון טריפסין / EDTA מהבקבוק ו פיפטה 3 מ"ל של טרי מראש חימם טריפסין / EDTA לתוך הבקבוק. דגירה את הבקבוק למשך דקה 1 ב 37 ° C לפני הוספת 5 מ"ל של GM כדי לעצור את trypsinization.
14. הסר את גליה מבקבוקון ידי חזר pipetting 10-15 פעמים, ולאחר מכן להעביר את התקשורת צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 200xg (1000rpm) במשך 8 דקות. הסר את supernatant ולהוסיף 10 מ"ל של GM, תאים לספור, 5x10 צלחת ⁵ תאים 12.5 מ"ל של GM לכל צלחת 10 ס"מ המכיל את coverslips.
15. הבורסה בינוני עם טרי מראש חימם GM כל 2-3 ימים. יום לפני לנתיחה הנוירון, להסיר את GM ולהחליף SFM (סעיף 2.2). השתמש SFM גליה ממוזג בשלב 4.12 כאשר הצפה תרבויות או קליפת המוח בהיפוקמפוס.

4. Dissection הקורטיקליים / או בהיפוקמפוס electroporation

1. הסר כמויות מתאימות של פתרונות nucleofection (Lonza), לשלב, חם לטמפרטורת החדר לפני תחילת הניתוח. מאז יש פתרון Nucleofection מוגבלת לכל החיים כאשר הוא משולב, אנחנו רק לשלב את הסכום הדרוש להכנת כל אחד (100 μL לכל transfection).
2. להרדים עכבר בהריון E15.5 עם CO ₂ (יום התקע E0.5) להסיר את הרחם כדי בצלחת פטרי 10 ס"מ. הסר עוברים לערוף לתוך קר DM (סעיף 2.1).
3. הסר את המוח כולו לתוך צלחת נפרדת של DM קר עם מחט טונגסטן כפופות, יש להסיר גם neocortices. הסר את קרומי המוח עם microforceps ו הקורטקס מקום לתוך צלחת החדש של DM קר. עם מספריים קטנים קשתית או Wecker, להסיר את קליפת המוח להיפוקמפוס או ומכניסים צינור 1.5 Eppendorf מ"ל מלאים 1.0 מ"ל של קר DM. שמור את זה צינור על הקרח.
4. לאחר לנתח כל קליפת המוח או hippocampi, להוסיף 110 μL של טריפסין 2.5% ל הצינור Eppendorf המכיל את הצינור רקמות מקום 37 ° C החממה במשך 20 דקות.
5. הסר את קליפת המוח supernatant לשטוף או hippocampi עם 1.0 מ"ל PM (סעיף 2.2) על ידי צינור היפוך בעדינות Eppendorf. חזור על לשטוף פעמיים, והשאיר 1 מ"ל של PM בצינור.
6. Triturate גושי 15 פעמים עם טפטפת P1000, ולהסיר תאים supernatant / לצינור 15 חדש חרוטי מ"ל המכיל 4 מ"ל של ראש הממשלה, להשאיר גושים שנותרו בצינור Eppendorf.
7. ספין שפופרת 15 מ"ל ב 20xg (350rpm) במשך 7 דקות עם הבלם משם. בטל supernatant ולהוסיף 100 μL של מעורבבים מראש, פתרון nucleofection הטמפרטורה בחדר (Lonza) עבור כל transfection. Triturate 5 פעמים בתנועות עדינות מעלה ומטה של ​​פיפטה P1000.
8. הסר 100 μL של התערובת nucleofection פתרון / תא הצינור כל Eppendorf חדשה ולהוסיף את הכמות המתאימה של ה-DNA. עבור תרבויות לטווח ארוך אנו משתמשים בדרך כלל 1-2μg של ה-DNA לכל transfection. עם זאת, תוויות רק חלק <10% קטן של נוירונים בתרבות. אנו משתמשים בדרך כלל 5-10μg של ה-DNA לכל transfection אם רוצים transfection יעילות גבוהה לתרבות לטווח קצר. השתמשנו עד לסך של 40μg של ה-DNA כאשר transfecting עם שני פלסמידים שונים. פלסמידים מאוחסנים TE למאגר ב 1μg / μL.
9. הוסף ההשעיה תא / DNA של קובט (Lonza) ו electroporate התאים Nucleofector (Lonza), באמצעות תוכנית O-005 (CNS נוירונים עכבר).
10. עבודה במהירות, להוסיף 500 μL של PM מראש התחמם equilibrated כדי קובט ולהסיר פתרון / התאים צינור חדש Eppendorf 1.5 מ"ל. הוסף PM מספיק כדי להביא את נפח transfection לכל mL 1.0. ספירת התאים עם hemocytometer צלחת בבית 3-5x10 ³ תאים / ס"מ ² עבור תרבויות צעירים, או 5-10x10 ³ תאים / ס"מ ² לטווח ארוך תרבויות.
11. עבור לטווח קצר תרבויות, להציף את הכלים תרבות 35mm עם 2.0 מ"ל של התחמם, CO _{2-equilibrated} SFM אחרי שעה אחת של ציפוי. אם אתה משתמש coverslips, אנו מסירים וחצי של ראש הממשלה ולהחליפה SFM, ולאחר מכן לחזור עוד פעמיים. או מציפים את חדרי הדמיה או לשטוף את תוצאות coverslips בתוכן בסרום נמוך מאוד (<0.5%). לטווח קצר תרבויות לא צריך להיות מתורבת בשכבה מזין גליה ולא צריך להיות מחדש נמאס.
12. עבור לטווח ארוך תרבויות, אנו להסיר coverslip גליה מכוסה המכיל שלוש נקודות של פרפין / וזלין ו להפוך אותו מעל החור 15mm בצלחת 35mm, שעה אחת לאחר ציפוי ראשוני. שני מיליליטרים של SFM המותנה מצלחת גליה הוא הוסיף אז אל חדר הדמיה. כדי להאכיל את לטווח ארוך תרבויות, אנו להסיר שליש SFM כל 2-3 ימים ולהחליף אותו SFM _{2-equilibrated} טרי, מחומם מראש ו-CO.

5. נציג תוצאות:

באיור 1. חיים נוירונים בהיפוקמפוס בשלבים רצופים של פיתוח. מותאמים תמונות של נציג חי נוירונים בהיפוקמפוס מוצגים גם תמונה הפרעות בניגוד דיפרנציאלי מיקרוסקופ פלואורסצנטי המקביל. כל התאים הללו כבר transfected עם טובולין ו-EGFP DsRed2 ב וקטורים pCAX. הנוירונים הם צילמו את הימים הבאים במבחנה (DIV): שלב 1 (1DIV), שלב 2 (1DIV), שלב 3 (2DIV), שלב 4 (11DIV) ואת שלב 5 (32DIV). סרגל קנה המידה 20μm.

דיון

פרוטוקול זה עבור עובריים culturing נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח עכבר פותחה כשינוי של פרוטוקול בנקאי, אשר משתמשת נוירונים ^1,2 חולדה. השתמשנו בפרוטוקול זה על עכבר culturing ונוירונים אוגר גם ^3,4,5,6,7. פרוטוקול זה פועל באותה מידה גם עבור שניהם נוירונים בהיפוקמפוס neocortical והוא דומה פרוטוקול שפורסם על ידי Meberg ומילר ^8. באופן כללי, אנו משתמשים נוירונים בהיפוקמפוס לתרבות לטווח ארוך כי הם מאופיינים היטב מערכת מודל מבוססות יותר. יתר על כן, הם עשויים להכיל אוכלוסיה הומוגנית יותר של נוירונים מאשר הניאוקורטקס. עם זאת, נוירונים בתרבית neocortical בפרוטוקול זה גם לשרוד להבדיל דומה (נתונים שלא פורסמו). אנו משתמשים באופן שגרתי נוירונים בהיפוקמפוס neocortical לתרבות לטווח קצר. Dissection של הניאוקורטקס גם התוצאות נוירונים באופן משמעותי יותר (1.5x10 ⁶ נוירונים בקליפת המוח לכל זוג) מאשר דיסקציה בהיפוקמפוס (2.5x10 ⁵ נוירונים לכל זוג hippocampi), מה שהופך אותו בחירה טובה יותר של חומר סופג המערבי, למשל.

כמו כל תרבות ראשוני, חיוני כדי למזער את הזמן שזה לוקח ממותו של בעל החיים כדי ציפוי של התאים. זה יהיה בדרך כלל לוקח 10-20 והניתוחים להיות מהיר בעקביות לנתיחה ו ציפוי. כמו כן, כאשר עובדים עם Nucleofector Lonza, חשוב לעבוד במהירות במהלך ההליך electroporation, כמו את הכדאיות של נוירונים פוחתת במהירות אם הם נותרו למאגר nucleofection.

הרבה הדמיה שלנו מתנהל עם סך מיקרוסקופ פלואורסצנטי פנימי ההחזרה (TIRFM). סוג זה של מיקרוסקופיה הוא מסוגל רק הדמיה מאות ננומטרים אחדים מעבר coverslip. לכן, אזורים של נוירונים שאנו לעתים קרובות תמונה, חרוט צמיחה axonal ו הקוצים הדנדריטים, צריך להיות דבק ישירות coverslip. לפיכך, אנו משתמשים בתרבויות צפיפות נמוכה שדורשים האכלה גליה לתרבות לטווח ארוך. השתמשנו תרבויות צפיפות גבוהה (> 2x10 ⁴ תאים / ס"מ ^2), ללא שכבות מזין גליה, לטווח ארוך תרבויות גילו כי הם שורדים טוב מאוד עם מעט האכלה. עם זאת, הקוצים הדנדריטים של נוירונים אלה הם לעתים קרובות גם הרחק המצע על התמונה TIRFM, למרות שהם יכולים להתגלות בקלות עם מיקרוסקופ שדה רחב או מיקרוסקופיה confocal.

ברוב המחקרים שלנו אנו transfect נוירונים לפני ציפוי, ויש להם צילמו חלבונים fluorescently שכותרתו לתקופה של עד שלושה חודשים בתרבות. ביטוי זה לטווח ארוך של חלבונים fluorescently שכותרתו נותן לנו בטחון באמצעות ריכוזים נמוכים של דנ"א (1-2μg) אנחנו לא מייצרים חפצים overexpression בתוך הנוירונים. עם זאת, הליך זה יכול לשמש גם כדי ללמוד overexpression של חלבונים אם כמויות גדולות של DNA משמשים (10-20μg). פלסמידים שבו אנו משתמשים כדי transfect נוירונים מכילים בדרך כלל EGFP או mCherry חלבונים היתוך, למרות שאנחנו גם התווית הציטופלסמה העצבית עם DsRed2 או EGFP לבד. טכניקה זו electroporation עובד היטב עם מספר וקטורים. אנחנו מעדיפים פלסמידים המכילים מקדם β-אקטין עם משפר CMV ו - β-גלובין מרובה זנב (pCAGGs או pCAX פלסמידים) ^9, עקב רמות גבוהות יחסית של ביטוי, ואת העובדה כי הם נסבל היטב על ידי הנוירונים בתרבות הן בטווח הקצר והן לטווח הארוך. באופן כללי, חלבונים מתחילים להביע בתוך כ -4 שעות של ציפוי להגיע לרמות מספיקות הדמיה תוך 10-24hrs ^10. השתמשנו בהצלחה CMV-האמרגן מונחה פלסמידים בתרבויות בטווח הקצר, אך גילו כי הם יכולים לגרום לרמות גבוהות של overexpression כי להרוג נוירונים בתרבית לטווח ארוך. עם זאת, מצאנו כי מיזוג של תרבויות גליה צפיפות נמוכה מסייעת להישרדות של נוירונים transfected עם CMV-האמרגן פלסמידים מונע, לעומת צפיפות (לא נמאס גליה) תרבויות גבוה יותר.

חומרים

* רוב ריאגנטים כי אנו מאחסנים ב -80 ° C יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C גם כן. אחסונם ב -80 ° C מאריך את חיי המדף שלהם ואת התוצאות בתרבויות מעט יותר עקבי.