השתלת צינורית לתוך Cisterna Magna במודל עכבר

תקציר

מקור: Xavier, A. L. R., et al. השתלת צינורית בבור המים של מכרסמים. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את הליך השתלת צינורית בבור המים של עכבר מורדם. הטכניקה כוללת הנחיית צינורית המותקנת על מחט דרך הדורה לתוך הבור המשולש ההפוך ואבטחתה לאספקה ממוקדת לנוזל השדרה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הליך כירורגי
   הערה: צינורית ה-cisterna magna הכרונית (CM) מאפשרת לבעלי החיים להתאושש מההליך הכירורגי. זריקות CM נעשות ביום שלאחר השתלת הצינורית, וחשוב מכך, ניתן לבצע אותן בבעלי חיים מורדמים או ערים. מכיוון שמדובר בניתוח החלמה, יש לבצע הליכים בתנאים סטריליים.
   1. שקלו את העכבר (C57BL/6JRj, שני המינים, 8 שבועות) והרדימו אותו בתערובת של קטמין וקסילזין (100 מ"ג/ק"ג; 10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה) באמצעות הזרקה תוך-צפקית (i.p). במידת הצורך, יש למנות מחדש את העכבר בחצי מנה של קטמין (50 מ"ג/ק"ג) במהלך ההליך הכירורגי. לחלופין, עבור קנולציה כרונית, הרדמו את העכבר על ידי הכנסתו לתא אינדוקציה איזופלורן ב-2.5 - 3% איזופלורן, בסביבות 1 ליטר לדקה חמצן (O₂). במקרה זה, השתמש בקונוס אף כדי לשמור על הרדמה איזופלורן ב-1.5 - 2% לאורך כל הניתוח.
   2. כאשר רפלקסים של צביטת הבוהן נפסקים והנשימה הופכת איטית ויציבה, הנח את החיה במסגרת סטריאוטקסית מעל כרית חימום.
   3. יש למרוח משחת עיניים. יש לחזור על הפעולה במהלך הניתוח במידת הצורך.
   4. לגלח את הראש והצוואר של העכבר, להסיר פרווה ולעקר עור חשוף תחילה עם ספוגית אלכוהול ולאחר מכן פעמיים עם כלורהקסידין (0.5%) או תמיסת יוד (2%). חזור על העיקור פעמיים נוספות.
      הערה: החלף את הווילון הכירורגי כדי להסיר פסולת ושיער לאחר הגילוח. לאחר מכן, עטפו את החיה כדי להגן על השדה הסטרילי.
   5. עבור קנולציה כרונית, יש לתת 0.5 - 1 מ"ל לידוקאין/בופיבקאין (1 מ"ג/מ"ל ו-0.25 מ"ג/מ"ל, בהתאמה) תת עורית (s.c.) במקום החתך. יש לתת בופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג) לשיכוך כאבים לאחר ניתוח.
   6. תקן את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית. לאחר הבטחת קיבוע, בין אם תוך אוזני או על ידי הקשת הזיגומטית, הטה מעט את הראש כך שהוא יוצר זווית של 120 מעלות לגוף (איור 1E).
   7. מצא את החלק של הגולגולת הבולט מיד מעל שרירי הצוואר - הפסגה העורפית. מרימים את העור שמעליו בעזרת פינצטה, וחותכים פיסת עור בצורת שקד באורך של כ-1 ס"מ לאורך קו האמצע. השתמש בצמר גפן או בחניתות עיניים כדי לשלוט בכל דימום שנוצר.
   8. השתמש בפסגה העורפית כנקודת ייחוס, פרק את רקמת החיבור השטחית כדי לחשוף את שרירי הצוואר שמתחת.
   9. הפרד את השרירים בקו האמצע על ידי העברת המלקחיים בזהירות באמצע אתר החתך בציר הקדמי לאחורי. עם זוג מלקחיים מעוקלים בכל יד, חברו את הקצוות באמצע ליד תחתית הגולגולת ומשכו את השרירים הצידה.
      הערה: זה אמור לחשוף את ה-CM, שמופיע כמשולש הפוך זעיר, המתוארת על ידי המוח הקטן למעלה והמדולה למטה, מאחורי הממברנה הדוראלית השקופה (איור 1B ו-1C).
   10. בעזרת חנית עיניים כירורגית או צמר גפן, נגב את הקרום הדוראלי המכסה את ה-CM.
2. החדרת הצינורית לתוך CM
   1. הסר את הצינורית מהמזרק המלאכותי המלא בנוזל המוח השדרתי (aCSF), תוך שמירה על מחט ה-30G מחוברת לקצה האחורי של הצינור.
   2. חבר את מחט ה-30G למזרק מזוקק מלא במים בנפח 100 מיקרוליטר המחובר למשאבת מזרק.
   3. הכנס בועת אוויר של כ-1 ס"מ לתוך הצינורית על ידי הוצאת אוויר בעזרת משאבת מזרק.
   4. בעזרת משאבת מזרק, משוך 12 מיקרוליטר מהעוקב הרצוי של נוזל המוח (CSF) לתוך הצינורית.
   5. אחוז בצינורית, המלאה בעוקב CSF, ליד המחט המכוסה בצינור עם זוג פינצטה מעוקלת המוחזקת ביד הדומיננטית. הנח את האצבע האמצעית של היד הלא דומיננטית על מוט האוזן של הצד הנגדי והחזק אותה יציבה לשימוש מאוחר יותר כמנוחה לצינורית.
   6. הכנס את הצינורית בזווית של 45 מעלות ביחס לראש העכבר, עובר למרכז ה-CM, המזוהה על ידי ההיבט המשולש שלו הנראה דרך הדורה. הימנע מכל חדירה של המוח הקטן או המדולה. ודא שהמחט מוכנסת רק לעומק של 1 - 2 מ"מ, כגון עד לנקודה שבה השיפוע נמצא כולו מתחת לדורה. שחרר את הפינצטה המחזיקה את הצינורית, ותן לצינורית לנוח על היד הלא דומיננטית.
      הערה: הקצה המשופע של מחטי השיניים ידרוש הפעלת כוח כלשהו כדי לנקב את הממברנה הדוראלית המכסה את ה-CM.
   7. במידת הצורך, יבש כל דליפת CSF עם החדירה באמצעות חנית עיניים כירורגית או צמר גפן.
   8. מרחו 2-3 טיפות דבק ציאנואקרילט על הממברנה הדוראלית המקיפה את הצינורית. הוסף טיפת מאיץ דבק כדי לרפא את הדבק באופן מיידי. מכסים את הגולגולת והמחט בתערובת של מלט דנטלי (כ- 0.5 מ"ג) ודבק ציאנואקרילט (3 - 5 טיפות). מיד לאחר מכן, יש למרוח טיפת מאיץ דבק לריפוי.

תוצאות

איור 1: הזרקת עוקבים לתוך בור המים מגנה. (א) סקירה סכמטית של ראש ומוח העכבר המציגה את מיקום הבור המגנה (CM) ביחס למבנה המוח והגולגולת. (B) פוטומיקרוגרף של CM חשוף אחרי ששרירי הצוואר שמסביב נותחו בצורה בוטה ונדחפו לצדדים....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
SOPIRA carpule 30G 0.3 x 12 מ"מ	Kulzer	AA001
Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate)	Meda AS		http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/
ספוגית אלכוהול 70% אלכוהול איזופרופיל 30 x 60 מ"מ	Vitrex Medical A/S	520213
Viskoese Oejendraeber Ophtha	Ophtha	145250
מוליך עץ, ניצן כותנה כפול (Ø בערך, 4 - 5 מ"מ, אורך בערך, 12 מ"מ)	Heinz Herenz	1032018
Eye spears	Medicom	A18005
Kimtech Science מגבונים מדויקים מגבי רקמות	Kimberly Clark Professional	5511
Loctite סופר דבק דיוק 5 גרם	Loctite		http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html
מאיץ קליפורניה Insta-Set	Bob Smith Industries	BSI-152
אבקת צמנט דנטלי	A-M Systems	525000
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS; 0.01 M; pH 7.4)	Sigma Aldrich	P3813
Ovalbumin, Alexa Fluor 647 מצומד	Thermo Fisher Scientific	O34784
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) תמיסה (1 מ"ג/מ"ל)	Thermo Fisher Scientific	62248
Dextran, פלואורסצאין, 3000 מגה-וואט, אניוניק	Thermo Fisher Scientific	D3305
קטמינול וטרינר 100 מ"ג/מ"ל (קטמין)	Intervet International BV	511519
Rompin Vet 20 מ"ג/מ"ל (קסילזין)	KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH	148999
קסילוקאין 20 מ"ג/מ"ל (לידוקאין)	AstraZeneca	158543
Marcain 2.5 מ"ג/מ"ל (bupivacain)	AstraZeneca	123918
Bupaq Vet 0.3 מ"ג/מ"ל (בופרנורפין)	Richter Pharma AG	185159