כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון.
1. הזרקת תאים מסומנים לאורגנואיד המוח
הערה: עבור מאמר זה, אורגנואידים מוחיים יוצרו באמצעות ערכה מסחרית לפי הוראות היצרן. ניתן להחליף זאת באורגנואיד המוחי המעניין. יש לקרר מראש את החומרים המשמשים בחלק זה של הפרוטוקול כדי למנוע ג'ל של מטריצת קרום הבסיס המסיס בטמפרטורות מעל 4 מעלות צלזיוס.
- הנח את מזרקי האינסולין, הקצוות והצינורות שעומדים להיות במגע עם מטריצת קרום הבסיס המסיס בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס כדי לאפשר להם להתקרר.
- הפשירו כמות בגודל מתאים של מטריצת קרום הבסיס המסיס על קרח, בהתאם למספר הזריקות שהולכות להתבצע (~2 מיקרוליטר/זריקה). הנסיעה אורכת כ-30 דקות.
- בזמן שהאליקוט מפשיר, פיצול, קצירה וספירה של התאים.
- חשב את הנפחים הדרושים לכל זריקה. אם מבצעים זריקות מרובות, הנח את הנפח הכולל של התאים בצינור של 1.5 מ"ל, והוסף עד 1 מ"ל של DMEM/F12.
הערה: יש להשתמש בנפח המאפשר כמה זריקות נוספות כדי לקחת בחשבון הפסדים/שגיאות פיפטינג. - הניחו את התאים בקרח בזמן הכנת השלבים הבאים.
- לאחר ההפשרה, יש לדלל את מטריצת קרום הבסיס המסיס לריכוז סופי של 3 מ"ג/מ"ל ב-DMEM/F12 קר כקרח.
- קח את התרחיף החד-תאי מהקרח, וסובב אותו ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
הערה: אם צנטריפוגה בקירור אינה זמינה, נראה שסיבוב בטמפרטורת החדר בדרך כלל נסבל. - הסר בעדינות את המדיום לחלוטין מבלי להפריע לגלולת התא. השעו מחדש את כדור התא על ידי פיפטינג עדין במטריצת קרום הבסיס המסיס המדולל (3 מ"ג/מ"ל) כדי לקבל נפח סופי של 2 מיקרוליטר לכל הזרקה לביצוע, והנח אותו מיד בחזרה על הקרח עד לשימוש.
הערה: יש לבצע את ההשעיה מחדש של התאים לאט ועם קצות מקוררים מראש כדי למנוע היווצרות בועות וג'ל. - העבירו את המזרקים המצוננים מראש מהמקפיא בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לדלי קרח. שמור אותם שם עד השימוש.
- הסר את הצלחת עם האורגנואידים במוח מהחממה. השתמש בקצה רחב כדי להעביר את האורגנואיד להזרקה לכלי 35 מ"מ. הסר את כל המדיום האפשרי מבלי לפגוע באורגנואיד כדי לייצב אותו ולהקל על ההזרקה.
הערה: חשוב להשתמש בקצוות רחבים כדי למנוע הרס האורגנואיד. אם הם אינם זמינים, חתוך את קצה קצה ה- P1,000 הרגיל במספריים סטריליים. - הנח את צלחת ה-35 מ"מ המכילה את האורגנואיד מתחת למיקרוסקופ חיתוך כדי לסייע בהנחיית ההזרקה ולהקל עליה.
הערה: אם אין מיקרוסקופ מנתח זמין באזור סטרילי, ניתן לבצע את ההזרקה ללא מיקרוסקופ, אם כי עם שליטה מופחתת במקצת. חלופה נוספת היא שימוש בלולאת הגדלה או משקפיים. - לאחר שהאורגנואידים מוכנים להזרקה, השעו בעדינות את התאים עם קצה פיפטה P20 מקורר, והעבירו 2 מיקרוליטר (המכילים את מספר התאים הרצוי להזרקה) על שקופית זכוכית סטרילית מקוררת מראש.
הערה: עבור זריקות מרובות, ניתן להוסיף נפח נוסף של 2 מיקרוליטר על פני שקופית הזכוכית. שמור אותו על קרח, והקפד להימנע מאידוי. - קח מזרק אינסולין מקורר מראש מהקרח, ומשוך לאט לאט את 2 המיקרוליטר של תרחיף התאים כששיפוע המחט פונה כלפי מטה כדי לאפשר את ספיגת כל התאים/מדיום.
הערה: הקפד ללכת לאט מאוד כדי להימנע משאיבת אוויר. - פתח את מכסה הכלי המכיל את האורגנואיד, ומקד את המיקרוסקופ עליו. החזק את המנה ביד אחת. הניחו את שיפוע המחט כלפי מעלה, וביד השנייה הזריקו את התאים לאט לתוך המשטח האורגנואידי.
הערה: חשוב להזריק לאט כדי למנוע נזק לרקמה. - לאחר ההזרקה, החזירו את המכסה לתוך הצלחת, ותנו לאורגנואיד המוזרק לשבת למשך 1-2 דקות.
הערה: זה מאפשר למטריצת קרום הבסיס המדוללת והמסיסה לג'ל, ולהחזיק את התאים במקומם. אם מוסיפים את המדיום מוקדם מדי, הוא יכול לשטוף את התאים היושבים על פני השטח. - מוסיפים בעדינות 500 מיקרוליטר מהמדיום האורגנואידי, ומעבירים את האורגנואיד עם קצה רחב קדח לבאר של צלחת של 24 בארות. דגרו את האורגנואיד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2 למשך הלילה. בצע החלפות מדיום מלאות כל יומיים.
הערה: חשוב לכלול אורגנואיד בקרה שלילי (מוזרק), שישמש להתאמות הדמיה. לשם כך, הזרקו אורגנואיד כמתואר קודם לכן עם מטריצת קרום בסיס מסיס מדולל (3 מ"ג/מ"ל) כדי לקבל נפח סופי של 2 מיקרוליטר ללא תאים.
