מאמר שיטה

בידוד מבוסס הידרוג'ל מתכלה של מושבות חיידקים במערכי מיקרובאר

29 באוגוסט 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Fattahi, N., et al. ממשקי הידרוג'ל מתכלים לסינון, בחירה ובידוד חיידקים. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את השימוש בהידרוג'לים מתכלים כדי לבודד מושבות חיידקים בתוך מערכי מיקרו-בארות סיליקון. תאי חיידקים נטענים תחילה למיקרו-בארות, עטופים בהידרוג'ל צולב ומתורבתים במושבות נפרדות. עם חשיפה לאור אולטרה סגול, פירוק ממוקד של ההידרוג'ל מאפשר מיצוי סלקטיבי של מושבות בודדות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. זני חיידקים ופרוטוקולי תרבית

  1. פסים מושבות של חיידקים על צלחות אגר בתוספת אמצעי גידול מתאימים. בדוח זה, Bacillus subtilis (זן 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) מתורבת על ATGN (0.079 M KH2PO4, 0.015 M (NH4)2SO4, 0.6 mM MgSO4·7H2O, 0.06 mM CaCl2·2H2O, 0.0071 mM MnSO4·H2O, 0.125 M FeSO4·7H2O, 28 מ"מ גלוקוז, pH: 7 ± 0.2, 15 גרם/ליטר אגר) צלחות אגר בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל ספקטינומיצין ו-Escherichia coli (זן 25922, ATCC) על צלחות אגר ATGN בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין.
    הערה: דיווחים קודמים על אנקפסולציה ושחרור הידרוג'ל עם חומרים אלה השתמשו במקום זאת בתאי A. tumefaciens C58
  2. בחר מושבות רצויות מצלחות אגר ATGN והתחל תרביות לילה. עבור זני E. coli ו-B. subtilis המשמשים כאן, תרבית ב-37 מעלות צלזיוס תוך ניעור ב-215 סל"ד במדיום נוזלי ATGN למשך 24 שעות. אחסן את תרביות התאים ב-50% גליצרול ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש עתידי.
  3. בחר מושבות של שני הזנים ממאגרי הגליצרול באמצעות לולאות חיסון סטריליות ודגר במדיה נוזלית ATGN למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-215 סל"ד.

2. הכנת החומר הדרוש להיווצרות הידרוג'ל

  1. סינתזה מתכלה של פולי (אתילן גליקול)-o-ניטרובנזיל דיאקרילט (PEG-o-NB-diacrylate)
    הערה: הסינתזה הפנימית של ה-PEG-o-NB-diacrylate תוארה היטב ודווחה בעבר. לחלופין, מכיוון שהסינתזה היא שגרתית, ניתן לבצע מיקור חוץ ממתקן סינתזה כימית.
  2. Crosslinking buffer
    1. קח את המתכון של המדיום שנבחר עבור זן החיידקים והכין מדיה עם פי 2 חומרים מזינים. הוסף פוספט, למשל, NaH2PO4, למדיום לריכוז סופי של 100 מ"מ. לאחר מכן, התאם את ערך ה-pH ל-8 באמצעות 5 M NaOH (aq).
    2. עקר את תמיסת החיץ ואחסן אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
      הערה: השאירו את כל מתכות המעבר הקיימות במדיה, מכיוון שמתכות אלו מזרזות את חמצון התיולים לדיסולפידים.
  3. PEG-o-NB-diacrylate solution
    1. עבור כל מ"ג של אבקת PEG-o-NB-diacrylate (משקל מולקולרי של 3,400 Da), הוסף 3.08 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד כדי להגיע לריכוז של 49 מ"מ של PEG-o-NB-diacrylate (ריכוז אקרילט של 98 מ"מ).
    2. מערבלים את התמיסה עד שהיא מעורבבת היטב ומאחסנים את התמיסה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  4. תמיסת PEG-thiol 4 זרועות
    1. להכנת PEG-thiol 4 זרועות (משקל מולקולרי של 10,000 Da), הוסף 4 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד למ"ג אבקה כדי להגיע לריכוז של 20 מ"מ (80 מ"מ של ריכוז תיול).
    2. מערבל תמיסה זו עד שהיא מעורבבת היטב ואחסן תמיסה זו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

5. ייצור מערכי מיקרובאר סיליקון ציפוי

  1. פארילן: השתמש בפרוטוקול הסטנדרטי המתואר במאמרי מחקר קודמים לציפוי פרוסות סיליקון בפארילן.
  2. מיקרו-ייצור: עקוב אחר הפרוטוקול המתואר בספרות כדי לתכנן ולייצר את מערך המיקרובאר (איור 1).
    הערה: טכניקות פוטוליתוגרפיות סטנדרטיות יושמו לייצור מערכי מיקרובאר על פרוסות סיליקון מצופות פארילן.

7. היווצרות הידרוג'ל על מערכי מיקרווול

  1. זרעי חיידקים במערכי מיקרווול
    הערה: 700 מיקרוליטר של 0.1 OD600 (צפיפות אופטית באורך גל של 600 ננומטר) נזרעו על מצעי מערך המיקרווול, ושיטת הרמת הפארילן יושמה להסרת תאים מהרקע.
  2. הכן את תמיסת מבשר ההידרוג'ל על ידי הוספת 5.6 מיקרוליטר של PEG-o-NB-diacrylate עם 12.5 מיקרוליטר של תמיסת מלח ATGN עם חוצץ פוספט pH 8 וערבוב עם 6.9 מיקרוליטר של תמיסת תיול PEG בעלת ארבע זרועות.
  3. פיפטה 12.5 מיקרוליטר של תמיסת המבשר על שקופית זכוכית פרפלואורואלקילית, לא תגובתית והנח שני מרווחי פלדה של 38 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) בשני צדדים מנוגדים של מצע מערך המיקרובאר המחוסנים בתאים.
  4. הפוך את שקופית הזכוכית הפרפלואורואלקילית עם טיפת תמיסת המבשר והנח את הטיפה באמצע מצע המיקרווול. לאחר מכן, דגרו למשך 25 דקות בטמפרטורת החדר (RT) להיווצרות הידרוג'ל.
  5. הסר בעדינות את שקופית הזכוכית ממצע המיקרווול. קרום ההידרוג'ל צריך להישאר מחובר למצע המיקרווול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
figure-results-1

איור 1: תכנון וייצור של מערכי מיקרו-באר. (א) טכניקות מיקרו-ייצור סטנדרטיות יושמו לייצור מערכי מיקרובאר על פרוסות סיליקון. (B) כל מצע היה מורכב ממערכים של 7 x 7 של בארות בקוטר 10 מיקרומטר עם עומק של 20 מיקרומ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אמוניום סולפטפישר כימיקלA702-500מוסמך ACS גרגירי
Bacillus subtilis 1A1135Bacillus Genetic Stock Center1A1135
מיקרוסקופ זקוף ברייטפילדאולימפוס תאגידBX51
סידן כלורי, נטול מיםפישר כימיקלC614-500לכדורי ייבוש, 4-20 רשת
DOWSIL 184 בסיס אלסטומר סיליקוןDow Silicones Corporation טמפרטורת אחסון: -30-60 °C
DOWSIL 184 חומר ריפוי אלסטומר סיליקוןDow Silicones Corporation טמפרטורת אחסון: < 32 C
ספקטרופוטומטר מיקרופלייט EPOCH2BioTek InstrumentsEPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922Thermo Fisher ScientificR19020
אתנול, נטול מיםFisher Chemical459844
Fisherfinest שקופיות מיקרוסקופ פרימיום רגילFisher Scientific12-544-4
תמיסת מי חמצןSigma-Aldrich216763-500MLמכיל מעכב, 30% משקל ב-H2O
IsopropanolSigma-Aldrich190764
מגנזיום גופרתי, 7-hydrateMacron Fine Chemicals6066-04Avantor Performance Materials, Inc.
מגיב מתנולסיגמא-אולדריץ'179337-4LACS, > 99.8%
חנקן, מתסון דחוסUN1066
פנטאריתריטול טטרה (מרקפטואתיל) פוליאוקסיאתילן (4 זרועות-PEG)NOF America CorporationPTE-100SHSunbright-PTE-100SH
פוספט חוצץ מלח (PBS), 10XVWR Amresco Life ScienceK813-500MLחנות בין 15 °C-30 °C
שקופיות מיקרוסקופ פרימיוםפישר סיינטיפיק12-544-425 x 75 x 1 מ"מ
נתרן כלוריסיגמא מדעי החייםS5886-500Gביו-ריאגנט, מתאים לתרבית תאים
נתרן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'S8045-500GBioXtra, > 98%, כדורים (נטולי מים)
נתרן פוספט מונו-בסיסי דיהידראטסיגמא-אולדריץ'71505-250GBioUltra, לביולוגיה מולקולרית, > 99.0% (T)
מד עובי נירוסטהמוצרי מותג דיוק77739

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים