הפרדת שברי הממברנה הפנימית והחיצונית של חיידקים גרם שליליים

תקציר

מקור: Cian, M. B. et al., הפרדת מעטפת התא עבור חיידקים גראם-שליליים לשברי ממברנה פנימיים וחיצוניים עם התאמות טכניות עבור Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את ההפרדה של חלקי הממברנה הפנימית והחיצונית של חיידקים גראם-שליליים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע סוכרוז. שברי הממברנה מטוהרים ומאוחסנים בטמפרטורות נמוכות לניתוח ממוקד של רכיבים ספציפיים לממברנה.

פרוטוקול

1. ריאגנטים כלליים והכנת מדיה למיצוי ממברנה

1. מצע גידול חיידקים: הכינו ועיקרו 1 ליטר של מצע מרק בבקבוק 2 ליטר מנוקה היטב וחיטוי.
2. מאגר השעיה כללי (1 M tris(hydroxymethyl) aminomethane buffer (Tris Buffer) pH 7.5; 50 מ"ל): ממיסים 6.05 גרם של בסיס Tris ב-30 מ"ל של H₂O. התאימו את ה-pH ל-7.5 עם 5 M HCl. התאימו את הנפח הסופי ל-50 מ"ל עם H₂O טהור במיוחד.
3. מלאי מאסטר של תמיסת כלציה דו-ערכית (0.5 M חומצה אתילנדיאמין טטראצטית, EDTA pH 8; 100 מ"ל): הוסף 18.6 גרם של דיסודיום אתילן טטראצטט·2H₂O עד 80 מ"ל של H₂O. מערבבים במרץ ומכוונים את ה-pH ל-8.0 עם נתרן הידרוקסיד (NaOH). כוונן את הנפח הסופי ל-100 מ"ל עם אולטרה-טהור H₂O.
   הערה: מלח הדיסודיום של EDTA לא יתמוסס עד שה-pH של התמיסה יותאם ל-~8.0 על ידי תוספת של NaOH.
4. בופר אוסמוטי A (0.5 מ' סוכרוז, 10 מ"מ טריס pH 7.5; 1 ליטר): שוקל 171.15 גרם סוכרוז ומעביר אותו לגליל של 1 ליטר. הוסף 10 מ"ל של 1 M Tris pH 7.5. התאימו לנפח סופי של 1 ליטר עם H₂O טהור במיוחד. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. ליזוזים (10 מ"ג/מ"ל; 5 מ"ל): שוקלים 50 מ"ג של ליזוזים (חלבון ביצת עוף) וממיסים ב-5 מ"ל H₂O טהור במיוחד. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. תמיסת כלציה דו-ערכית מדוללת (1.5 מ"מ EDTA; 500 מ"ל): הוסף 1.5 מ"ל של 0.5 מ' EDTA (שלב 1.3) ל-497.5 מ"ל H₂O טהור במיוחד.
7. בופר אוסמוטי B (0.2 מ' סוכרוז, 10 מ"מ טריס pH 7.5; 2 ליטר): שוקלים 136.8 גרם סוכרוז ומעבירים אותו לגליל של 2 ליטר. הוסף 20 מ"ל של 1 M Tris pH 7.5. התאימו את הנפח הסופי ל-2 ליטר עם H₂O טהור במיוחד. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
8. קו-פקטור נוקלאז (1 M מגנזיום כלוריד, MgCl₂; 10 מ"ל): ממיסים 2.03 גרם של MgCl₂·6H₂O ב-8 מ"ל של H₂O טהור במיוחד. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
9. קוקטייל תמיסת נוקלאז כולל אנזימי RNase ו-DNase: ראה טבלת חומרים. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
10. קוקטייל מעכב פרוטאז: ראו טבלת חומרים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
11. תמיסת שיפוע סוכרוז איזופיקנית בצפיפות נמוכה (20% w/v סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ תמיסת Tris pH 7.5; 100 מ"ל): שוקלים 20 גרם סוכרוז ומעבירים לגליל של 200 מ"ל. הוסף 100 מיקרוליטר של 1 M Tris Buffer pH 7.5 ו-200 מיקרוליטר של 0.5 M EDTA pH 8. כוונן את הנפח הסופי ל-100 מ"ל עם H₂O טהור במיוחד יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
12. תמיסת שיפוע סוכרוז איזופיקנית בצפיפות בינונית (53% w/v סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ תמיסת Tris pH 7.5; 100 מ"ל): שוקלים 53 גרם סוכרוז ומעבירים לגליל מדורג של 200 מ"ל. הוסף 100 מיקרוליטר של 1 M Tris Buffer pH 7.5 ו-200 מיקרוליטר של 0.5 M EDTA pH 8. כוונן את הנפח הסופי ל-100 מ"ל עם H₂O טהור במיוחד. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
    הערה: הכן תמיסה זו בצילינדר מדורג כדי להבטיח דיוק בשל אחוז הסוכרוז הגבוה. מוסיפים מוט ערבוב מגנטי ומערבבים עד שהסוכרוז נמס לחלוטין בתמיסה. תהליך זה עשוי להימשך מספר שעות.
13. תמיסת שיפוע סוכרוז איזופיקנית בצפיפות גבוהה (73% משקל/נפח סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ תמיסת Tris pH 7.5; 100 מ"ל): שוקלים 73 גרם סוכרוז ומעבירים לגליל מדורג של 200 מ"ל. הוסף 100 מיקרוליטר של 1 M Tris Buffer pH 7.5 ו-200 מיקרוליטר של 0.5 M EDTA pH 8. כוונן את הנפח הסופי ל-100 מ"ל עם H₂O טהור במיוחד. אחסן בטמפרטורת החדר.
    הערה: הכן תמיסה זו בצילינדר מדורג כדי להבטיח דיוק בשל אחוז הסוכרוז הגבוה. מוסיפים מוט ערבוב מגנטי ומערבבים עד שהסוכרוז נמס לחלוטין. תהליך זה עשוי להימשך מספר שעות.
14. מאגר אחסון ממברנה מבודדת (10 מ"מ Tris Buffer pH 7.5; 1 ליטר): הוסף 1 מ"ל של 1 M Tris Buffer pH 7.5 לבקבוק של 1 ליטר והתאם את הנפח הסופי ל-1 ליטר עם H₂O טהור במיוחד.

2. הכנת חיידקים למיצוי ממברנה

1. פס את החיידקים ממלאי גליצרול קפוא על צלחות אגר טריות. אחסן את הצלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאחר התפתחות המושבות. חסנו מושבה בודדת לתוך שפופרת של 5 מ"ל מלאה במצע מרק ותרבו את החיידקים לפי הצורך למשך הלילה.
2. יש לדלל לאחור את תרבית החיידקים למשך הלילה ל-1 ליטר של מצע מרק מועדף ולתרבית את החיידקים עד להשגת הצפיפות האופטית הרצויה.
   הערה: חיסון מושבת חיידקים בודדת ל-1 ליטר של מצע מרק מומלץ עבור גנוטיפים מוטנטיים הנוטים לדכא פנוטיפים של גדילה, אך חלק מהחיידקים הגראם-שליליים פשוט גדלים לאט יותר מאחרים. אם לא ניתן להשיג צפיפות גידול מספקת על ידי חיסון במושבה אחת, דילול לאחור של תרבית בן לילה לליטר אחד של מדיה היא אסטרטגיה אחת לסנכרון הצמיחה. הרכב הממברנה החיידקית משתנה בהתאם לשלב הגידול של התרבית (שלב לוגריתמי לעומת שלב נייח). עקומות גדילה המודדות את השינוי בצפיפות האופטית של תרביות החיידקים כפונקציה של זמן צריכות להתבצע עם כל הזנים כדי לתאם את צפיפות התרבות עם שלב הגידול.
3. הניחו את הצלוחיות המכילות את תרביות המרק על קרח. קרא את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD₆₀₀) וחשב את נפח התרבית השווה בין 6.0 ל-8.0 x^{10 11} יחידות יוצרות מושבת חיידקים (CFU). עבור S. Typhimurium, זה מתאים ל-1 ליטר של תרבית ב-OD₆₀₀ של בין 0.6 ל-0.8, מכיוון ש-OD600 של 1.0 שווה בערך ל-1.0x10⁹ CFU/mL. הוסף נפח זה לצינור צנטריפוגה וודא שהתרביות הנותרות יישארו על הקרח עד לשימוש בהן.
4. גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס ב-7,000-10,000 x g בצנטריפוגה מהירה בזווית קבועה למשך 10 דקות.
   הערה: מצננים מראש ושומרים על הצנטריפוגות בטמפרטורה נמוכה. שמור את הדגימות על קרח במהלך כל ההליך.
5. שפכו והשליכו את הסופרנטנט בזהירות.
   הערה: אם לא ניתן לחלץ את שברי הממברנה באופן מיידי, ניתן להקפיא את הגלולה ו/או לאחסן אותה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. עם זאת, מומלץ להמשיך ישירות עם פלסמוליזה באותו יום בו נקצרים התאים, במיוחד עבור מינים שאינם אנטרובקטריאליים.

3. דיסוציאציה של הממברנה החיצונית ופלסמוליזה

1. הפשירו את כדורי התא על קרח אם הם אוחסנו בעבר בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, ושמרו את הדגימות על הקרח למשך שארית ההליך. השעו מחדש כל כדור תא בתוך צינור הצנטריפוגה ב-12.5 מ"ל של מאגר A. הוסף מוט ערבוב מגנטי לתרחיף התאים.
2. הוסף 180 מיקרוליטר של 10 מ"ג/מ"ל ליזוזים (ריכוז סופי של 144 מיקרוגרם/מ"ל) לכל השעיה מחדש של תאים. שמור את הדגימות על קרח תוך כדי ערבוב למשך 2 דקות.
3. הוסף 12.5 מ"ל של תמיסת EDTA של 1.5 מ"מ לכל תרחיף תאים והמשיך לערבב על קרח למשך 7 דקות נוספות.
4. שפכו את המתלה לצינור חרוטי של 50 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 9,000-11,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
5. השליכו סופרנטנטים למיכל פסולת ביולוגית ושמרו את הכדורים על קרח.
6. הוסף 25 מ"ל של מאגר B לגלולת התא.
7. הוסף 55 מיקרוליטר של 1 M MgCl₂, 1 מיקרוליטר של מגיב נוקלאז RNase/DNase (כדי למנוע בעיות צמיגות הקשורות לחיידקים העוברים פלסמוליזה לפני הומוגניזציה), ו-1 מיקרוליטר של קוקטייל מעכב פרוטאז לנפח המאגר B שיושב על גבי גלולת התא
8. השעו מחדש את הגלולה בתערובת המאגר B. פיפטה ומערבולת נמרצות עד לצפייה בתמיסה הומוגנית.
   הערה: חשוב מאוד שיהיה פתרון הומוגני לפני שממשיכים לשלב 4 של פרוטוקול זה. התאים המרחפים צריכים להיות בעלי מראה ועקביות דמויי בלילת עוגה צמיגה.
9. מערבולת כל דגימה למשך 15 שניות. שמור על מתלים על קרח והמשך לשלב 4.

4. הומוגניזציה בלחץ וליזה
הערה: ניתן להשתמש במספר שיטות לליזה. סוניקציה אינה אידיאלית בגלל יצירת חום. ניתן להשיג ליזה אוסמוטית, אך לרוב אינה יעילה. לכן, אנו ממליצים על ליזה בלחץ גבוה. ניתן להשיג ליזה בלחץ גבוה באמצעות מגוון מכשירים. אנו מציעים מכונות הומוגניזציה, כגון העיתונות הצרפתית או ה-Emusliflex. אנו עובדים עם סוגים רבים של חיידקים גראם-שליליים שתגובתם לתמיסות סוכרוז אוסמולריות גבוהות משתנה. שלב ההומוגניזציה בלחץ גבוה משפר את היעילות, השחזור והתפוקה.

1. מצננים מראש את תא העיתונות הצרפתית ב-4 מעלות צלזיוס או מכניסים את סליל המתכת ממכונת ההומוגנייזר על קרח.
2. יוצקים את הדגימה לתא הלחץ הצרפתי או לגליל דגימת ההומוגנייזר ומכניסים את התא ללחץ ההומוגניזציה הרצוי (10,000 psi אמור להספיק בעת שימוש במכבש צרפתי או 20,000 psi בעת שימוש בהומוגנייזר).
3. כוונן את קצב זרימת היציאה לכטיפה אחת לשנייה תוך שמירה על הלחץ אם אתה משתמש במכבש צרפתי.
4. אסוף את הליזאט של התא בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל תוך שמירת דגימות על קרח.
5. חזור על שלבים 4.2-4.4 שלוש עד חמש פעמים כדי להשיג ליזה מלאה, מה שבדרך כלל מסומן על ידי עלייה הדרגתית בשקיפות הדגימה.
   הערה: יש לשטוף את תא הדגימה ולאזן אותו עם מאגר B בין הדגימות.
6. שמור תאים ליזים על קרח.

5. צנטריפוגה כוללת של פיצול הממברנה

1. את דגימות החיידקים הליזים ב-6,169 x g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את חומר התא השלם שנותר. (למשל, תאי חיידקים לא ליזים).
2. חלקו את החלק הנותר של הסופרנטנט, המכיל כעת את הממברנות ההומוגניות, לבקבוק פוליקרבונט לאולטרה-צנטריפוגה.
   זהירות: במידת הצורך, ניתן לאזן דגימות תאים על ידי דילול עם בופר B.
3. אולטרה-צנטריפוגה התא ליזאט ב-184,500 x גרם למשך שעה אחת לפחות, ב-4 מעלות צלזיוס. ניתן לבצע שלב זה בן לילה מבלי להשפיע על איכות הממברנות.
4. השליכו את הסופרנטנט שנותר בצינור האולטרה-צנטריפוגה ושמרו את כדוריות הממברנה על הקרח (איור 1).
5. השעו מחדש את כדורי הממברנה ב-1 מ"ל של תמיסת השיפוע האיזופיקנית-סוכרוז בצפיפות נמוכה באמצעות הומוגנייזר זכוכית-Dounce. העבירו את הדגימה הומוגנאט לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה פסטר מזכוכית ושמרו על קרח.
   הערה: אם רוצים רק ניתוח הרכב הממברנה הכולל, החלף 1 מ"ל של תמיסת שיפוע איזופיקנית-סוכרוז בצפיפות נמוכה עבור 1 מ"ל של מאגר אחסון ממברנה מבודד. שלב 5.5 הוא נקודת הסיום של הבידוד אם רוצים רק דגימות ממברנה חיידקיות כוללות. אחסן דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שיידרש ניתוח נוסף במורד הזרם.

6. אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות להפרדת הממברנות הכפולות

1. אסוף את המספר המתאים של 13 מ"ל פוליפרופילן או צינורות פתוחים שקופים במיוחד המיועדים לרוטור דלי מתנדנד ואולטרה-צנטריפוגה.
2. החזק את הצינור במצב מוטה מעט והכן את שיפוע הסוכרוז על ידי הוספה איטית של תמיסות סוכרוז מצפיפות גבוהה יותר לצפיפות נמוכה יותר בסדר הבא: 2 מ"ל של 73% w/v סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ Tris pH 7.54 מ"ל של 53% w/v סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ Tris pH 7.5
   1. הבא, הוסף את חלק הממברנה הכולל (1 מ"ל), שהושעה מחדש בתמיסת סוכרוז של 20% W/V (שלב 5.5). הימנע מערבוב שבר הממברנה עם תמיסת הסוכרוז שנמצאת מתחתיו. חלוקות צריכות להיות גלויות בין כל אחת מהשכבות הללו.
   2. לבסוף, מלאו את הצינור בתמיסת שיפוע איזופיקנית-סוכרוז בצפיפות נמוכה (כ-6 מ"ל). יש למלא צינורות פוליפרופילן וצינורות פתוחים שקופים במיוחד מלאים ככל האפשר (2 או 3 מ"מ מהחלק העליון של הצינור) לתמיכה בצינור.
3. התאמה עבור Acinetobacter baumannii 17978
   1. התאם שיפוע סוכרוז מותאם לשימוש עם דגימות חיידקים שונות. עבור A. baumannii, שיפוע הסוכרוז הבא העניק הפרדה מלאה יותר של הממברנות (איור 2).2 מ"ל של 73% w/v סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ Tris pH 7.54 מ"ל של 45% w/v סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ Tris pH 7.5
   2. לאחר מכן, הוסף את חלק הממברנה הכולל (1 מ"ל), שהושעה מחדש בתמיסת סוכרוז של 20% w/v (שלב 5.5). הימנע מערבוב שבר הממברנה עם תמיסת הסוכרוז שנמצאת מתחתיו. חלוקות צריכות להיות גלויות בין כל אחת מהשכבות הללו.
   3. לבסוף, מלאו את הצינור בתמיסת שיפוע איזופיקנית-סוכרוז בצפיפות נמוכה (כ-6 מ"ל). יש למלא צינורות פוליפרופילן וצינורות פתוחים שקופים במיוחד מלאים ככל האפשר (2 או 3 מ"מ מהחלק העליון של הצינור) לתמיכה בצינור.
4. אולטרה-צנטריפוגה את הדגימות באמצעות רוטור דלי מתנדנד ב-288,000 x g ו-4 °C למשך הלילה.
   הערה: עבור הנפחים ששימשו בשלבים הקודמים, אנו ממליצים על זמני צנטריפוגה בין 16 שעות ל-23 שעות.
5. חותכים את קצה קצה הפיפטה P1000 כ -5 מ"מ מהנקודה. בעזרת הפיפטה, הסר את שכבת הממברנה הפנימית (IM) החומה העליונה. העבירו את שבר ה-IM לבקבוק פוליקרבונט לאולטרה-צנטריפוגה.
6. השאירו כ-2 מ"ל מתמיסת הסוכרוז מעל הממשק של 53-73% כדי להבטיח שהממברנה החיצונית הלבנה התחתונה (OM) אינה מזוהמת עם שבר ה-IM. חזור על הליך הפיפטינג משלב 6.4 עבור שבר ה-OM (איור 1).
   הערה: ניתן לאסוף את הממברנות גם על ידי ניקוב צינורות הצנטריפוגה בתחתית בעזרת מחט ואיסוףם כשברים טיפתיים.
7. מלאו את החלל שנותר של צינור האולטרה-צנטריפוגה במאגר אחסון ממברנה מבודדת וערבבו על ידי היפוך או פיפטינג. שמור את הדגימות על קרח.
8. אסוף את הממברנות השטופות והמבודדות כעת על ידי אולטרה-צנטריפוגה ב-184,500 x g למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס.
9. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הממברנות על ידי הומוגניזציה של Dounce. הוסף 500-1000 מיקרוליטר של מאגר אחסון. אסוף דגימות בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל.
10. אחסן את דגימות הממברנה החיידקית בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

תוצאות

איור 1: סכמטי המתאר את הליך בידוד הממברנה החיידקית הגראם-שלילית המתואר במאמר שיטות זה. ההליך המשמש לאיסוף תאי חיידקים ולבידוד הממברנות הכוללות, הפנימיות (IM) והחיצוניות (OM) מוצג. הגישה מסתמכת על הצפיפות המוגברת של שכבת ה-OM הדו-שכבתית עבור חיידקים אלה בה...

חומרים