1. קצירת דגימות למיצוי פוליפוספט
- גידול חיידקים בתנאי העניין לקביעת תכולת polyP. עבור פרוטוקול זה, יש לגדל לקטובצילוס ראוטרי בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מבלי לנער במדיום אינדוקציה של אנזים מאלי (MEI) ללא ציסטאין (MEI-C).
- קצור מספיק תאים על ידי צנטריפוגה בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל עד לסך של 50 - 100 מיקרוגרם של חלבון תאי (ראה שלב 3 להלן). עבור E. coli, מדובר ב-1 מ"ל של תרבית פאזה לוג ב-A600 של 0.2 - 0.4. עבור לקטובצילוס ראוטרי, מדובר ב-1 מ"ל של תרבית לילה. התאם לפי הצורך למינים אחרים מעניינים.
- הסר לחלוטין את הסופרנטנט מכדוריות התא.
- השעו מחדש את כדורי התא ב-250 מיקרוליטר של מאגר ליזה GITC (4 M guanidine isothiocyanate, 50 mM Tris-HCl, pH 7) וליזה על ידי דגירה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אחסן ליזטים ב-80 מעלות צלזיוס.
הערה: היה עקבי עם זמן הליזיס, שכן דגירה ממושכת בטמפרטורה גבוהה עלולה לגרום לפירוק של polyP על ידי הידרוליזה. ניתן לאחסן ליזאטים ללא הגבלת זמן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
זהירות: גואנידין איזותיוציאנט הוא מלח כאוטרופי ויש לטפל בו בכפפות ולהשליך אותו כפסולת מסוכנת.
2. מדידת תכולת החלבון של ליזטים של תאים
- הכינו תקני אלבומין בסרום בקר (BSA) המכילים 0, 0.1, 0.2 ו-0.4 מ"ג מ"ל-1 של BSA במאגר הליזה של GITC.
הערה: חשוב לבצע את תקני ה-BSA ב-GITC, מכיוון ש-GITC משפיע על התפתחות הצבע של מבחן ברדפורד. ניתן לאחסן תקני BSA ללא הגבלת זמן ב-20 מעלות צלזיוס. - Aliquot 5 מיקרוליטר של ליזטים של תאים מופשרים ומעורבים היטב ושל תקני BSA להפרדת בארות בצלחת ברורה של 96 בארות.
- הוסף 195 מיקרוליטר של מגיב ברדפורד לכל באר ומדוד ספיגה ב-595 ננומטר (A595) בקורא צלחות (ראה טבלת חומרים).
- חשב את כמות החלבון בכל באר בהשוואה לעקומה הסטנדרטית של BSA, באמצעות הנוסחה y = mx + b, כאשר y הוא A595, x הוא מיקרוגרם של BSA, m הוא השיפוע של העקומה הסטנדרטית, ו-b הוא יירוט y של העקומה הסטנדרטית. הכפל את הערך המתקבל ב-0.05 כדי לקבוע את סך מ"ג החלבון בכל דגימה.
3. מיצוי פוליפוספט
- הוסף 250 מיקרוליטר של 95% אתנול לכל דגימה ומערבולת GITC לערבוב.
- מרחו את התערובת הזו על עמוד ספין של קרום סיליקה וצנטריפוגה למשך 30 שניות ב-16,100 x גרם.
- השליכו את הזרימה, ולאחר מכן הוסיפו 750 מיקרוליטר של 5 מ"מ Tris-HCl (pH 7.5), 50 מ"מ NaCl, 5 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), 50% אתנול וצנטריפוגה למשך 30 שניות ב-16,100 x גרם.
- השלך את הזרימה והצנטריפוגה למשך 2 דקות ב-16,100 x גרם.
- הנח את העמוד בצינור מיקרופוגה נקי של 1.5 מ"ל והוסף 150 מיקרוליטר של 50 מ"מ Tris-HCl (pH 8).
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, ולאחר מכן הוצאת polyP על ידי צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-8,000 x g.
הערה: אם תרצה, ניתן לאחסן את הפליטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שבוע לפחות.
4. עיכול פוליפוספט
- הכן תקנים המכילים 0, 5, 50 או 200 מיקרומטר אשלגן פוספט ב-50 מ"מ Tris-HCl (pH 8).
הערה: ניתן לאחסן תקני אשלגן פוספט ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר. - Aliquot 100 מיקרוליטר מכל תקן פוספט ושל דגימות polyP שחולצו לבארות נפרדות של צלחת שקופה של 96 בארות.
- הכן תערובת מאסטר המכילה (לכל דגימה): 30 מיקרוליטר של מאגר תגובה 5x ScPPX (100 מ"מ Tris-HCl, 25 מ"מ MgCl2, 250 מ"מ אמוניום אצטט, pH 7.5)13, 19 מיקרוליטר של H2O, ו-1 מיקרוליטר של ScPPX מטוהר (1 מ"ג מ"ל-1).
- הוסף 50 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל באר של צלחת 96 הבארות. דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: אם תרצה, ניתן לאחסן את דגימות הפוליP המעוכלות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן.
5. איתור פוספט חופשי
- הכן בסיס תמיסת זיהוי על ידי המסת 0.185 גרם של אנטימון אשלגן טרטרט ב-200 מ"ל מים, הוספת 150 מ"ל של 4 N H2SO4, ולאחר מכן הוספת 1.49 גרם אמוניום הפטמוליבדט. מערבבים להמסה ואז מביאים לנפח סופי של 456 מ"ל. יש לסנן את התמיסה כדי להסיר חלקיקים ולאחסן מוגן מפני אור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
- הכינו תמיסת מלאי של חומצה אסקורבית 1 M. יש לאחסן מוגן מאור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד.
- הכן מלאי עבודה טרי של תמיסת זיהוי בכל יום על ידי ערבוב של 9.12 מ"ל של בסיס תמיסת זיהוי עם 0.88 מ"ל של חומצה אסקורבית 1 M. אפשר לתמיסת הזיהוי להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת זיהוי לכל דגימה ותקן בצלחת 96 בארות ודגירה בטמפרטורת החדר למשך כ-2 דקות כדי לאפשר התפתחות צבע.
- מדוד את הספיגה ב-882 ננומטר עם קורא צלחות וחשב את ריכוז הפוספט של כל דגימה בהשוואה לעקומה הסטנדרטית של אשלגן פוספט.
זהירות: תמיסת הזיהוי מכילה מלחים רעילים וחומצות חזקות. ללבוש כפפות ולהתייחס לתמיסה עודפת כפסולת רעילה.
6. חישוב תכולת פוליפוספט סלולרי
- המר את ריכוזי הפוספט שנקבעו בשלב 5.5 לננומול של פוספט שמקורו בפוליP בכל ליזאט תא שלם על פי הנוסחה הבאה:
nmol polyP = 1.5 x (μM פוספט / 10)
הערה: השיטה הסטנדרטית מבוססת העקומה בשלב 5 קובעת את ריכוז הפוספט (במיקרומטר) בכל דגימת פוליP של 100 מיקרוליטר המצוטטת בשלב 4.2. כדי להמיר ריכוז זה למספר של ננומול, 100 מיקרוליטר מחולק ב-106 כדי לקבל נפח ב-L, כפול הריכוז (מיקרומול L-1), ואז מוכפל ב-1,000 (מספר הננומול במיקרומול). זה מצטמצם לחלוקת הריכוז ב-10. נפח התמצית הכולל שהוכן בשלב 3 הוא 150 מיקרוליטר, ולכן יש צורך להכפיל את הערך המתקבל ב-1.5 כדי לחשב את הננומול של הפוספט הקיים בתמצית כולה. - נרמל את תכולת ה-polyP התאית לסך החלבון התאי על ידי חלוקת nmol polyP ב-mg הכולל של החלבון בכל דגימה שנקבעה בשלב 1.4. רמות PolyP מתבטאות במונחים של ריכוז פוספט חופשי בודד שמקורו ב-polyP.
הערה: במקרים מסוימים, כמות הפוספט שמקורו ב-polyP הקיימת בדגימה עשויה ליפול מחוץ לטווח הליניארי של עקומת תקן הפוספט. אם רמות ה-polyP גבוהות מאוד, ניתן לדלל את הפליטה העודפת המכילה polyP משלב 3.6 ב-1:10 או 1:100, לפי הצורך, ולאחר מכן למדוד שוב כמתואר בשלבים 4 עד 6.
