בדיקת שכפול לגיונלה פנאומופילה במקרופאגים שטופלו מראש בשלפוחיות הממברנה החיצונית

תקציר

מקור: Jung, A. L. et al., שלפוחיות הממברנה החיצונית של Legionella pneumophila: בידוד וניתוח הפוטנציאל הפרו-דלקתי שלהם על מקרופאגים. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את הטיפול המקדים במקרופאגים עם שלפוחיות הממברנה החיצונית של לגיונלה פנאומופילה (OMVs) כדי לבחון את השפעתם על שכפול חיידקים. על ידי שינוי האיתות החיסוני של המארח, OMVs הופכים את המקרופאגים למתירניים יותר לזיהום. ספירת מושבות גבוהה יותר בתאים שטופלו, בהשוואה לתאים שלא טופלו, מצביעה על כך ש-OMV מקדמים שכפול של L. pneumophila בתוך מקרופאגים.

פרוטוקול

1. מקרופאגים לפני הטיפול

1. הכינו תאי THP-1 (תאי רפואת ילדים של בית החולים טוהוקו-1, קו תאי לוקמיה מונוציטית אנושית).
   הערה: THP-1 הוא קו תאים מונוציטי שמקורו בחולה לוקמיה.
   1. הוסף 2x10⁵ תאי THP-1 לכל 24 בארות והבדיל אותם על ידי הוספת 20 ננומטר פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA) לתאים דמויי מקרופאגים. יש לדגור למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   2. החלף את המדיום ב-500 מיקרוליטר של מדיום טרי ודגר למשך 24 שעות נוספות; המדיום האופטימלי לתאי THP-1 כולל גלוקוז גבוה של מכון רוזוול פארק (RPMI) 1640 בתוספת 10% סרום עגל עוברי.
2. לבודד את המקרופאגים שמקורם במח העכברים (mBMDM).
3. טפל במקרופאגים שמקורם ב-THP-1 או mBMDM עם שלפוחיות ממברנה חיצוניות (OMVs).
   1. הפשירו את ה-OMVs והוסיפו אותם למקרופאגים אנושיים או עכברים בהתאם לכמות החלבון שלהם (0.1, 1 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל). דגרו את המקרופאגים עם OMV בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות לפחות.

2. להדביק את המקרופאגים ולהעריך את שכפול החיידקים באמצעות בדיקת יחידה יוצרת מושבה (CFU)

1. השתמש ב-Legionella pneumophila, תאי THP-1 או mBMDM שטופלו מראש משלב 4.3, ולא מקרופאגים שטופלו מראש כבקרות (2x10⁵/24 בארות). אל תחליף את המדיום.
2. להדביק תאי THP-1 עם L. pneumophila Corby WT ו-mBMDM עם מוטציה חסרת פלאגלין של L. pneumophila Corby (שניהם עם ריבוי זיהום (MOI) של 0.5; 1x10⁵ L. pneumophila/24 בארות) ולדגור במשך 24 ו-48 שעות, בהתאמה.
3. לזרוק את התאים במדיום שלהם על ידי תוספת של ספונין (ריכוז סופי: 0.1%) ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
4. השעו מחדש את החיידקים על ידי פיפטינג והעבירו את התרחיף לכלי תגובה. הכן דילולים סדרתיים של המדיה המכילה L. pneumophila בתמיסת מלח סטרילית עם חוצץ פוספט (PBS).
5. פס 50 מיקרוליטר מהדילולים הנדרשים על צלחות אגר תמצית שמרי פחם (BCYE) ודגירה למשך 3 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
6. ספרו חזותית את המושבות שנוצרו. חשב את CFU

<

img class='image_resized' style='aspect-ratio:305/40;width:75%;' src='https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/23949/Equation_1_editor_23949.jpg' alt='Equation_1.jpg' />

נרמל את תוצאת ספירת ה-CFU למקרופאגים לא מטופלים מראש אלא נגועים, המוגדרים ל-100%.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10 cm petridish	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, גרמניה)	82.1473
פחם פעיל	Carl Roth GmbH & Co KG (קרלסרוהה, גרמניה)	X865.2
Agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (קרלסרוהה, גרמניה)	5210.2
אגר קולומביה עם 5% דם כבשים	Becton Dickinson GmbH (היידלברג, גרמניה)	254005
Ferric nitrate nonahydrate	Carl Roth GmbH & Co KG (קרלסרוהה, גרמניה)	5632.1
סרום עגל עוברי (FCS)	Life Technologies GmbH (דרמשטדט, גרמניה)	10270-106
Heracell 240i חממת פחמן דו חמצני	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (בראונשווייג, גרמניה)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (בראונשווייג, גרמניה)	75004515
לולאת חיסון	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, גרמניה)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---	באדיבות על ידי פרופ' ד"ר אנטיה פליגר (RKI, ברלין, גרמניה)
L. pneumophila Corby ΔflaA	---	---	באדיבות על ידי פרופ' ד"ר קלאוס הונר (RKI, ברלין, גרמניה)
mBMDM	---	---	באדיבות על ידי פרופ' ד"ר מרקוס שנארה (אוניברסיטת פיליפס מרבורג, מרבורג, גרמניה) ופרופ' ד"ר קרסטן קירשנינג (אוניברסיטת דואיסבורג אסן, אסן, גרמניה)
PBS	Biochrom GmbH (ברלין, גרמניה)	L 1825
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, גרמניה)	P8139-1MG
שייקר מסתובב (MaxQ 6000)Thermo	Fisher Scientific Germany BV & Co KG (בראונשווייג, גרמניה)	SHKE6000
RPMI 1640 High Glucose	Life Technologies GmbH (דרמשטדט, גרמניה)	11875-093
Saponin	Carl Roth GmbH & Co KG (קרלסרוהה, גרמניה)	9622.1
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (קיימברידג', אנגליה)	80-2116-30
THP-1	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, גרמניה)	88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (בראונשווייג, גרמניה)
תמצית שמרים	Carl Roth GmbH & Co KG (קרלסרוהה, גרמניה)	2363.2

ניתן ניתן ניתן