הליך לקצירת חיידקים וליזה מכנית

תקציר

מקור: Mercier, N., et al. טיהור MS2-Affinity יחד עם ריצוף RNA בחיידקים גרם חיוביים. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים הליך שלב אחר שלב לקצירת תאי חיידקים וליזוי מכני שלהם כדי לשחרר תוכן תוך תאי.

פרוטוקול

1. קצירת חיידקים

זהירות: שלב זה כולל טיפול בחיידקים פתוגניים.

1. גדל מושבה אחת של זנים הנושאים פלסמידים pCN51-P3-MS2-sRNA או pCN51-P3-MS2 ב-3 מ"ל של מדיום עירוי לב מוח (BHI) בתוספת אריתרומיצין (10 מיקרוגרם/מיקרוליטר) בכפילויות.
2. יש לדלל כל תרבית לילה ב-50 מ"ל (≈1/100) של מדיום BHI טרי בתוספת אריתרומיצין (10 מיקרוגרם/מיקרוליטר) כדי להגיע ל-OD_{600 ננומטר} של 0.05. השתמש בצלוחיות מעוקרות של 250 מ"ל (יחס של 5:1 בקבוק לבינוני).
   הערה: יש להגדיר תנאי גידול בינוניים ובהתאם לדפוס הביטוי של ה-sRNA שנחקר.
3. לגדל תרביות ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-180 סל"ד למשך 6 שעות.
4. מעבירים כל תרבית לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
5. צנטריפוגה בטמפרטורה של 2,900 x גרם במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. שמור כדורים על קרח ובצע ישירות ליזה מכנית של תאים או הקפאה ואחסון כדורים ב-80 מעלות צלזיוס.

2. ליזה של תאים מכניים

זהירות: יש לבצע את השלבים הבאים על קרח והמאגרים חייבים להיות ב-4 מעלות צלזיוס. השתמש בכפפות ונקוט בכל אמצעי הזהירות כדי להגן על דגימות מפני RNases.

1. השעיית כדורים (שלב 1.6) ב-5 מ"ל של מאגר A (150 מ"מ KCl, 20 מ"מ Tris-HCl pH 8, 1 מ"מ MgCl₂ ו-1 מ"מ DTT).
2. העבירו את התאים התלויים בצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל עם 3.5 גרם חרוזי סיליקה (0.1 מ"מ).
3. הכנס צינורות למכשיר מכני לליזה של תאים. הפעל מחזור של 40 שניות ב-4.0 m/s.
   הערה: אם מחזור אחד אינו מספיק כדי לשבור תאים, הניחו למכשיר להתקרר למשך 5 דקות תוך שמירה על דגימות על קרח. לאחר מכן, חזור על מחזור נוסף של 40 שניות במהירות של 4.0 מ' לשנייה. ניתן לבדוק את יעילות ליזיס התאים על ידי ציפוי הסופרנטנט על צלחת BHI-agar.
4. צנטריפוגה ב-15,700 x גרם למשך 15 דקות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה	Falcon	352070
צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל	פלקון	352051
בקבוק תרבית 250 מ"ל	דומיניק דוטשר	2515074	תרביות חיידקים
BHI (עירוי לב מוח) מרק	סיגמא-אולדריץ'	53286	מדיום גידול
אריתרומיצין (ארי)	סיגמא-אולדריץ'	פלוקה 45673	מדיום גידול
מטריצת ליזינג B בתפזורת	MP ביומדיקל	6540-428	ליזה מכנית
RNAPro פתרון	MP ביומדיקל	6055050	ליזה מכנית
מכשיר FastPrep	MP ביומדיקל	116004500
ספקטרופוטומטר ליזה מכני Genesys 20	תרביות חיידקים	ThermoFisher Scientific	11972278