בידוד של RNA מטרה חיידקי רגולטורי קטן הקשור ל-RNA באמצעות טיהור זיקה

תקציר

מקור: Mercier, N., et. al., MS2-Affinity Purification יחד עם ריצוף RNA בחיידקים גראם-חיוביים. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את הבידוד של RNA רגולטורי קטן (sRNA) מתויג MS2 הקשור ל-RNA היעד החיידקי שלו באמצעות טיהור זיקה עם חלבון קושר מלטוז (MBP)-MS2 היתוך חלבון מעטפת משותק על שרף עמילוז.

פרוטוקול

מאגרים ומדיה לניסויי

MAPS, הכינו את המאגרים והמדיה הבאים:- מאגר A (150 מ"מ KCl, 20 מ"מ Tris-HCl pH 8, 1 מ"מ MgCl₂ ו-1 מ"מ DTT)- מאגר E (250 מ"מ KCl, 20 מ"מ Tris-HCl pH 8, 12 מ"מ מלטוז, 0.1% טריטון, 1 מ"מ MgCl₂ ו-1 מ"מ DTT)

הכנת עמודות

זהירות: היזהר לא לאפשר לשרף העמילוז להתייבש. במידת הצורך, אטמו את העמוד במכסה קצה. הכן את כל הפתרונות לפני שמתחילים בטיהור הזיקה.

1. שים עמוד כרומטוגרפיה במתלה עמודים.
2. הסר את קצה העמוד ושטוף את העמוד במים טהורים במיוחד.
3. הוסף 300 מיקרוליטר שרף עמילוז.
4. שטפו את העמוד עם 10 מ"ל של מאגר A.
5. יש לדלל 1,200 pmol של חלבון MBP (חלבון קושר מלטוז)-MS2 ב-6 מ"ל של Buffer A ולטעון אותו לעמודה.
6. שטפו את העמוד עם 10 מ"ל של מאגר A.

טיהור זיקה MS2 (איור 1)

1. טען את הליזאט של התא לתוך העמודה.
   הערה: שמור 1 מ"ל של ליזאט התא (תמצית גולמית, CE) כדי לחלץ את סך ה-RNA ולבצע ניתוח כתם צפוני ותעתיק.
2. אסוף את שבר הזרימה (FT) בצינור איסוף נקי.
3. שטפו את העמוד 3 פעמים עם 10 מ"ל של מאגר A. אוספים את שבר הכביסה (W).
4. הוצא את העמודה עם 1 מ"ל של מאגר E ואסוף את שבר הפליטה (E) במיקרו-צינור של 2 מ"ל.
5. שמור את כל השברים שנאספו על קרח עד למיצוי RNA או הקפיא אותם ב-20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.

תוצאות

איור 1. איור סכמטי של פרוטוקול MAPS המותאם לסטפילוקוקוס זהוב. מבניית פלסמיד ועד ניתוח נתונים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה	Sarstedt	72.690.001
צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל	Falcon	352070
2 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה	Starstedt	72.691
בקבוק תרבית 250 מ"ל	דומיניק דוטשר	2515074	תרביות חיידקים
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה צנטריפוגה	352051 פלקון		צנטריפוגה
שרף עמילוז	ניו אינגלנד BioLabs	E8021S	MS2 טיהור זיקה
pMBP-MS2	Addgene	65104	ייצור MS2-MBP
עמודת כרומטוגרפיה Poly-Prep	BioRad	7311550	טיהור זיקה MS2