בידוד של RNA מטרה חיידקי רגולטורי קטן הקשור ל-RNA באמצעות טיהור זיקה

תקציר

מקור: Mercier, N., et. al., MS2-Affinity Purification יחד עם ריצוף RNA בחיידקים גראם-חיוביים. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את הבידוד של RNA רגולטורי קטן (sRNA) מתויג MS2 הקשור ל-RNA היעד החיידקי שלו באמצעות טיהור זיקה עם חלבון קושר מלטוז (MBP)-MS2 היתוך חלבון מעטפת משותק על שרף עמילוז.

פרוטוקול

מאגרים ומדיה לניסויי

MAPS, הכינו את המאגרים והמדיה הבאים:- מאגר A (150 מ"מ KCl, 20 מ"מ Tris-HCl pH 8, 1 מ"מ MgCl₂ ו-1 מ"מ DTT)- מאגר E (250 מ"מ KCl, 20 מ"מ Tris-HCl pH 8, 12 מ"מ מלטוז, 0.1% טריטון, 1 מ"מ MgCl₂ ו-1 מ"מ DTT)

הכנת עמודות

זהירות: היזהר לא לאפשר לשרף העמילוז להתייבש. במידת הצורך, אטמו את העמוד במכסה קצה. הכן את כל הפתרונות לפני שמתחילים בטיהור הזיקה.

1. שים עמוד כרומטוגרפיה במתלה עמודים.
2. הסר את קצה העמוד ושטוף את העמוד במים טהורים במיוחד.
3. הוסף 300 מיקרוליטר שרף עמילוז.
4. שטפו את העמוד עם 10 מ"ל של מאגר A.
5. יש לדלל 1,200 pmol של חלבון MBP (חלבון קושר מלטוז)-MS2 ב-6 מ"ל של Buffer A ולטעון אותו לעמודה.
6. שטפו את העמוד עם 10 מ"ל של מאגר A.

טיהור זיקה MS2 (איור 1)

1. טען את הליזאט של התא לתוך העמודה.
   הערה: שמור 1 מ"ל של ליזאט התא (תמצית גולמית, CE) כדי לחלץ את סך ה-RNA ולבצע ניתוח כתם צפוני ותעתיק.
2. אסוף את שבר הזרימה (FT) בצינור איסוף נקי.
3. שטפו את העמוד 3 פעמים עם 10 מ"ל של מאגר A. אוספים את שבר הכביסה (W).
4. הוצא את העמודה עם 1 מ"ל של מאגר E ואסוף את שבר הפליטה (E) במיקרו-צינור של 2 מ"ל.
5. שמור את כל השברים שנאספו על קרח עד למיצוי RNA או הקפיא אותם ב-20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.

תוצאות

איור 1. איור סכמטי של פרוטוקול MAPS המותאם לסטפילוקוקוס זהוב. מבניית פלסמיד ועד ניתוח נתונים.

חומרים