$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת זני חיידקים או ספריות מוטנטיות
1. פס את הזנים לבדיקה על צלחות אגר מתאימות. אלה צלחות מלאי לניסוי.
1. דגרו את הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה הרצויה כדי להשיג מושבות בודדות. לצורך ניסוי זה, תרבית K. pneumoniae (NTUH-K2044 ו-ATCC43816 זנים) על אגר מרק לוריא (LB) ב-37 מעלות צלזיוס, ו-S. pneumoniae (סוג בר 23F ו-23F Δcps) על אגר דם בצנצנת נרות לחה ב-37 מעלות צלזיוס.
2. בחר מושבה בודדת מצלחת ציר (שלב 1.1) כדי לחסן 10 מ"ל מרק מתאים באמצעות לולאה סטרילית או מקל קוקטייל. לסינון של ספריות מוטנטיות אקראיות, חסנו את המרק ב-10 מיקרוליטר ממלאי הספרייה המוטנטית האקראית (ספריית TraDIS).
1. דגירה של זני K. pneumoniae במצע LB דל מלח ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות, וזני S. pneumoniae בתקשורת עירוי לב מוח (BHI), סטטית ב-37 מעלות צלזיוס.
2. העבירו את תרבית הלילה לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה בצנטריפוגה ספסל למשך 10 דקות ב-3,200 x g בדליים מתנדנדים החוצה עם תוספות צינור של 15 מ"ל ומכסים הדוקים לאירוסול.
3. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של מי מלח 1x חוצץ פוספט (PBS).
הערה: השלך סופרנטנט דרך מסלול הפסולת הביולוגית הנוזלית המתאים במעבדה. מטרת שלבי הצנטריפוגה וההשעיה מחדש (1.2.2 ו-1.2.3) היא לרכז את החיידקים להדמיה קלה על השיפוע. ניתן להעמיס תרביות חיידקים ישירות על השיפוע אם מעדיפים. זנים בעלי כמוסות כבדות עשויים שלא ליצור כדור הדוק. אם זה קורה, הסר כמה שיותר סופרנטנט מבלי להסיר תאי חיידקים, הוסף 1x PBS לנפח סופי של 5 מ"ל והשהה מחדש את הגלולה. המשך את הפרוטוקול עם שלב 1.2.5.
5. צנטריפוגה של הצינורות כמתואר בשלב 1.2.2.
6. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של 1x PBS. התאים מוכנים כעת לשימוש.
הערה: הצפיפות של תרחיף תאי החיידק אינה ביקורתית,l אך צריכה להיות מספיקה להדמיה בשיפוע. מוצע מינימוםOD 600 (צפיפות אופטית ב-600 ננומטר) של 4.