הפרדת חיידקים לפי כמות כמוסה באמצעות שיפוע צפיפות לא רציף

תקציר

מקור: Feltwell, T., et.al. הפרדת חיידקים לפי כמות כמוסה באמצעות שיפוע צפיפות לא רציף. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את השימוש בשיפוע צפיפות לא רציף להפרדת זני חיידקים על סמך כמות הקפסולה. על ידי צנטריפוגה של ספריית מוטנטים של טרנספוזון דרך השיפוע, חיידקים עם צפיפות קפסולה שונה מתמקמים לשכבות נפרדות. לאחר מכן ניתן לאסוף את השברים המופרדים לניתוח במורד הזרם.

פרוטוקול

1. הוספת תאים מוכנים לשיפועים והפרדה על ידי צנטריפוגה

1. הוסף 600 מיקרוליטר של תאים מוכנים לחלק העליון של השיפוע בצינור לאט מאוד ומבלי לערבב את הממשק.
2. הנח את הצינורות במתאמי צינורות ושקול את המתאמים והצינורות המשולבים כדי להבטיח שהם מאוזנים.
   1. הנח את מתאמי הצינור ברוטור בעל זווית קבועה בתוך צנטריפוגה על ספסל. צנטריפוגה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 3,000 x גרם.
   2. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הצינורות, הנח אותם במתלה מתאים וצלם את התוצאות כתיעוד.
3. שחזר את שברי החיידקים לצורך כימות חומצה אורונית או מיצוי DNA.
   1. אם אין צורך ביישומים במורד הזרם, השלך את הדגימות/שיפועים דרך מסלול הפסולת הביולוגית הנוזלית המתאים במעבדה.
      הערה: חשוב לאמת את ההפרדה עבור זנים/זנים חדשים של חיידקים. יש לבחון שברים בודדים מהשיפוע על ידי מיקרוסקופיה, על ידי בדיקת חומצה אורונית, או בדיקה כמותית מתאימה אחרת כדי לאשר את פנוטיפ הקפסולה של כל שבר. אם המטרה היא להפריד על סמך צבירה או גודל תא, יש להשתמש במבחנים מתאימים עצמאיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
צנטריפוגה 5810R עם רוטור A-4-81 ודלי 500 מ"ל	Eppendorf	5810 718.007
מתאמים לצינורות 15 מ"ל	Eppendorf	5810 722.004
רוטור זווית קבועה F-34-6-38	Eppendorf	5804 727.002
2.6 - 7 מ"ל מתאם צינור	Eppendorf	5804 739.000
צנטריפוגה 5424 כולל רוטור FA-45-24-11	Eppendorf	5424 000.460
5 מ"ל צינור תחתון עגול פוליפרופילן	Falcon	352063