הפרדת חיידקים לפי כמות כמוסה באמצעות שיפוע צפיפות לא רציף

Abstract

מקור: Feltwell, T., et.al. הפרדת חיידקים לפי כמות כמוסה באמצעות שיפוע צפיפות לא רציף. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את השימוש בשיפוע צפיפות לא רציף להפרדת זני חיידקים על סמך כמות הקפסולה. על ידי צנטריפוגה של ספריית מוטנטים של טרנספוזון דרך השיפוע, חיידקים עם צפיפות קפסולה שונה מתמקמים לשכבות נפרדות. לאחר מכן ניתן לאסוף את השברים המופרדים לניתוח במורד הזרם.

Protocol

1. הוספת תאים מוכנים לשיפועים והפרדה על ידי צנטריפוגה

1. הוסף 600 מיקרוליטר של תאים מוכנים לחלק העליון של השיפוע בצינור לאט מאוד ומבלי לערבב את הממשק.
2. הנח את הצינורות במתאמי צינורות ושקול את המתאמים והצינורות המשולבים כדי להבטיח שהם מאוזנים.
   1. הנח את מתאמי הצינור ברוטור בעל זווית קבועה בתוך צנטריפוגה על ספסל. צנטריפוגה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 3,000 x גרם.
   2. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הצינורות, הנח אותם במתלה מתאים וצלם את התוצאות כתיעוד.
3. שחזר את שברי החיידקים לצורך כימות חומצה אורונית או מיצוי DNA.
   1. אם אין צורך ביישומים במורד הזרם, השלך את הדגימות/שיפועים דרך מסלול הפסולת הביולוגית הנוזלית המתאים במעבדה.
      הערה: חשוב לאמת את ההפרדה עבור זנים/זנים חדשים של חיידקים. יש לבחון שברים בודדים מהשיפוע על ידי מיקרוסקופיה, על ידי בדיקת חומצה אורונית, או בדיקה כמותית מתאימה אחרת כדי לאשר את פנוטיפ הקפסולה של כל שבר. אם המטרה היא להפריד על סמך צבירה או גודל תא, יש להשתמש במבחנים מתאימים עצמאיים.

Materials