מבחן In Vivo למתאם ביולומינסנציה חיידקית עם צפיפות תאים

תקציר

מקור: Brodl, E., et al. מדידה באתרה ומתאם של צפיפות תאים ופליטת אור של חיידקים ביו-לומינסצנטיים. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים את המדידה והמתאם של ביולומינסנציה עם צפיפות תאים בחיידקים שעברו טרנספורמציה. מושבת חיידקים בודדת משמשת להתחלת תרבית נוזלית. התרבות מונחת בבאר בריכוז התאים הרצוי. אנטיביוטיקה ומשרה מתווספים כדי לבטא את הגן הנדרש לביולומינסנציה של חיידקים. קריאות לספיגה וביו-לומינסנציה נלקחות במרווחי זמן קבועים באמצעות קורא צלחות.

פרוטוקול

1. תכנון, הכנה וביטוי של אופרון הלוקס ב-Escherichia coli

הערה: ראה טבלת חומרים למידע על ערכות מסחריות המשמשות בסעיף זה.

1. להעברת אופרון הלוקס ל-E. coli בחר וקטור pET סטנדרטי עם אתרי הגבלה מתאימים וגן עמידות לאנטיביוטיקה מעניין (למשל, pET28a; NcoI, XhoI, kanamycin).
2. תכנן את השברים והפריימרים החופפים להרכבת גיבסון על סמך רצף ה-DNA של Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
3. הגדר תגובת שרשרת פולימראז סטנדרטית (PCR) עם הפריימרים המעוצבים וה-DNA הגנומי המבודד (חומצה דאוקסיריבונוקלאית) של Photobacterium mandapamensis 27561 כתבנית.
   הערה: בידוד ה-DNA הגנומי של זן החיידקים המתאים משפר את יעילות ה-PCR.
4. טהר את מוצר ה-PCR באמצעות טיהור עמודת ספין.
5. בצע עיכול הגבלה של וקטור pET28a המבודד עם NcoI ו-XhoI ב-37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
6. טהר את הווקטור הליניארי ואת שברי ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וטיהור עמוד הספין שלאחר מכן.
7. קבע את ריכוז ה-DNA של כל שבר ואת הווקטור הליניארי, וחשב את הכמויות האופטימליות להרכבה על פי הפרוטוקול.
   הערה: יעילות ההרכבה תלויה בגודל ומספר השבר ויש להתאים אותה בהתאם לפרוטוקול היצרן.
8. לאחר שילוב כל השברים והמאגר בצינור PCR, דגרו את תערובת ההרכבה במכונת PCR בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שעה.
9. הפוך את התוצר הווקטורי המורכב על פי פרוטוקולי טרנספורמציה סטנדרטיים לטרנספורמציה של פלסמיד חיידקי E. coli למערכת E. coli מתאימה לשכפול פלסמיד בעל תפוקה גבוהה (למשל, E. coli TOP10 או XL-1).
10. בחר מושבות מלוח הטרנספורמציה ופס על צלחות חדשות לבידוד DNA.
11. לבודד DNA פלסמיד על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
12. כדי לאמת את ההרכבה הנכונה של הפלסמיד, כולל כל השברים, בצע תחילה PCR מושבה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים באמצעות פריימרים ספציפיים לכל שבר מורכב.
13. בנוסף ל-PCR של המושבה ואלקטרופורזה של ג'ל אגרוז שלאחר מכן, הכינו את כל וקטורי ההרכבה המבודדים לריצוף DNA כדי לאמת את ההרכבה הנכונה ואת רצפי ה-DNA הנכונים.
14. הפוך את הפלסמיד המאומת על פי פרוטוקולי טרנספורמציה סטנדרטיים לטרנספורמציה של פלסמיד חיידקי E. coli למערכת E. coli מתאימה לייצור חלבון בעל תפוקה גבוהה (למשל, E. coli BL21).
    הערה: המשך ישירות עם פרוטוקול הביטוי למטה. לאחסון ארוך יותר, מומלץ להכין ציר גליצרול.

2. ביטוי של זני E. coli מותאמים

1. הכן תרבית לילה (ONC) לביטוי על ידי חיסון של נפח מתאים של מדיום לוריא-ברטני (LB) (למשל, 100 מ"ל) עם מלאי הגליצרול שהוכן בעבר של תאי E. coli BL21 שעברו טרנספורמציה עם הפלסמיד המורכב או ישירות מלוח טרנספורמציה. הוסף 100 מיקרוליטר של קנמיצין (50 מ"ג/מ"ל; גן עמידות לאנטיביוטיקה של pET28a) ודגר את ה-ONC ב-37 מעלות צלזיוס ו-120 סל"ד בשייקר אינקובטור למשך הלילה.
2. לחסן את תרבית הביטוי העיקרית (למשל, 800 מ"ל של מדיום LB) ב-8 מ"ל של ה-ONC ולהוסיף 800 מיקרוליטר של קנמיצין (50 מ"ג/מ"ל).
3. דגרו את התרבות הראשית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו -120 סל"ד בשייקר חממה עד שצפיפות התאים מגיעה ל- OD₆₀₀ של 0.6 - 0.8 (כ -2.5 שעות).
4. הפחיתו את טמפרטורת הדגירה ל-28 מעלות צלזיוס.
5. לגרום לביטוי חלבון על ידי הוספת פרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לריכוז סופי של 0.1 mM.
   הערה: בדיקות אמפיריות הראו כי הפחתת הטמפרטורה ל-28 מעלות צלזיוס נתנה את עוצמת האור הגבוהה ביותר.
6. התבונן בתאים עד שהם מתחילים לזרוח (כשעה).
   הערה: בהתאם למטרת הביטוי, התאים גדלים עד למחרת ואז נקצרים, או שניתן להמשיך לרעוד התאים כל עוד הם זוהרים (מקסימום 48 שעות). קצירת התאים וטיהור כל החלבונים יכולים להיעשות על פי נהלים סטנדרטיים.

3. ביטוי של זני ביולומינסנט חיידקיים

הערה: זני ביולומינסנט חיידקיים דורשים מצע גידול ספציפי/מדיום מי ים מלאכותי לצמיחה וייצור אור.

1. הכן מדיום מי ים מלאכותי המורכב משני רכיבי מדיום שהוכנו בנפרד.
   הערה: הכמויות הבאות מיועדות ל-1 ליטר מדיום נוזלי או 1 ליטר מדיום אגר.
   1. עבור מדיום מי הים המלאכותי, שקלו את המלחים הבאים: 28.13 גרם NaCl (נתרן כלורי), 0.77 גרם KCl (אשלגן כלורי), 1.60 גרם CaCl₂ · 2H₂O (סידן כלוריד דיהידרט), 4.80 גרם MgCl₂ · 6H₂O (מגנזיום כלוריד הקסהידרט), 0.11 גרם NaHCO₃ (נתרן ביקרבונט), ו-3.50 גרם MgSO₄ · 7H₂O (מגנזיום גופרתי הפטהידרט).
   2. מוסיפים 1 ליטר מים מזוקקים וממיסים את כל הרכיבים.
   3. עבור מדיום LB, שקלו את המרכיבים הבאים: 10 גרם תמצית שמרים, 10 גרם פפטון, ולצלחות אגר, 20 גרם אגר נוספים.
   4. מוסיפים 250 מ"ל מי ברז וממיסים את הרכיבים.
   5. חיטוי שני המדיה המוכנה בנפרד ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   6. עבור צלחות אגר, שלבו 250 מ"ל של מדיום LB עם 750 מ"ל של מדיום מי ים מלאכותי מיד לאחר החיטוי והכינו צלחות.
   7. עבור מדיום נוזלי, שלב 250 מ"ל של מדיום LB עם 750 מ"ל של מדיום מי ים מלאכותי מיד לאחר החיטוי או כאשר הוא מקורר.
      הערה: מדיום מי הים המלאכותי עלול להיות עכור באמצעות משקעי מלח.
2. פס את זני הביו-לומינסנט של החיידקים על צלחות אגר בינוניות של מי ים מלאכותיים ודגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 24 - 30 מעלות צלזיוס.
   הערה: אחסון זמן רב של זני חיידקים מושג בדרך כלל באמצעות הקפאת מלאי גליצרול של תרבית החיידקים. יש תמיד לפספס זנים על צלחות אגר תחילה כדי להבטיח תנאי התחלה אחידים לכל הזנים, לפני השימוש בתרביות נוזליות, עקב שלב פיגור בצמיחה לאחר ההפשרה.
3. הכן ONC על ידי חיסון 100 מ"ל של מדיום מי ים מלאכותי עם מושבה אחת מהצלחת. דגרו את ה-ONC בטמפרטורה של 24 - 30 מעלות צלזיוס ו-120 סל"ד בשייקר אינקובטור למשך הלילה.
4. חיסון 800 מ"ל של מדיום מי ים מלאכותי עם 8 מ"ל ONC.
5. דגרו את תאי החיידקים בטמפרטורה של 24 - 30 מעלות צלזיוס ו-120 סל"ד בשייקר אינקובטור.
   הערה: פרופיל עוצמת האור של חיידקים ביולומינסנט משתנה מאוד עם הטמפרטורה. בהתאם למנגנוני הרגולציה של ייצור האור של זן החיידקים המתאים, פליטת האור עשויה להתחיל לאחר כ-1 - 6 שעות.
6. התבונן בתרביות תאי חיידקים עד שהן מתחילות לזרוח (בערך 1-6 שעות).
   הערה: בהתאם למטרת הביטוי, התאים גדלים עד למחרת ואז נקצרים, או שניתן להמשיך לרעוד התאים כל עוד הם זורחים. קצירת התאים וטיהור כל החלבונים יכולים להיעשות על פי נהלים סטנדרטיים.

4. בדיקת פעילות in vivo עבור זני ביולומינסנט חיידקיים וזני E. coli מותאמים

הערה: אחסון זמן רב של זנים מושג בדרך כלל באמצעות הקפאת מלאי גליצרול של תרבית החיידקים. יש תמיד לפספס זנים על צלחות אגר תחילה כדי להבטיח תנאי התחלה אחידים לכל הזנים, לפני השימוש בתרביות נוזליות, עקב שלב פיגור בצמיחה לאחר ההפשרה.

1. פס את זן החיידקים הביולוגי הרצוי או זן E. coli שונה על צלחת אגר ודגירה ב-28 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   הערה: טמפרטורת הדגירה יכולה להשתנות מזן לזן ויש להעריך אותה אמפירית. כדי להיות מסוגל להשוות זני חיידקים ביולומינסנט וזני E. coli שעברו שינוי, תנאי הגידול צריכים להיות זהים.
2. יש לחסן 3 מ"ל של מדיום עם הזן המתאים עם מושבה אחת מצלחת אגר ולדגור את התאים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד בשייקר אינקובטור למשך כ-1-2 שעות.
3. מדוד את צפיפות התאים של דילול של 1:10 של התרבית הנוזלית ב-650 ננומטר. חשב את היחס והנפח עבור תרבית 1 מ"ל עם OD650 של 0.05.
   הערה: בדיקת קורא הלוחות הבאה תקבע את צפיפות התא ב-650 ננומטר כדי למנוע הפרעות על ידי פליטת האור של הזנים.
4. פיפטה את נפח התרבות והמדיום המחושב לצלחת בעלת קירות שחורים של 24 בארות עם תחתית זכוכית. עבור זן E. coli ששונה, הוסף 1 μL של kanamycin (עמידות לאנטיביוטיקה של וקטור pET28a) ו-1 μL של IPTG (אינדוקציה של ביטוי גנים) לדגימות . הנח מכסה על הצלחת כדי למנוע אידוי במהלך המדידות.
   הערה: כדי להבטיח שהווקטור pET28a המכיל את כל אופרון הלוקס לא יאבד על ידי תרבית E. coli, יש להוסיף קנמיצין לכל דגימת E. coli בבארות הצלחת וכדי להבטיח שניתן למדוד את ייצור האור של תאי E. coli, ביטוי הגנים חייב להיות מושרה על ידי IPTG. כדי למנוע הפרעות הצלבה ומדידה, לוחות באר בעלי קירות שחורים עם תחתיות זכוכית ומכסים שקופים הראו את התוצאות הטובות ביותר. עם זאת, ניתן להבחין בדיבור צולב, ויש לבחור עמדות היטב בקפידה.
5. התחל את המדידה בקורא צלחות.
   הערה: פרוטוקול קורא הלוחות מבוסס על סקריפט שפותח במיוחד עבור בדיקה זו המשלב שתי מדידות, ספיגה וביו-לומינסנציה. נקודות נתונים נאספות כל 10 דקות עם טלטול קבוע בין המדידות וטמפרטורה קבועה של 28 מעלות צלזיוס.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Kit	New England Biolabs Inc.	E2621S	עבור 10
rxndx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad Phusion Polymerase	Thermo Scientific	F530S
Q5 High Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs Inc.	M0491S
GeneJet ערכת טיהור DNA גנומי	Thermo Scientific	K0721	עבור 50
אנזימי הגבלה rxn ומאגר (NcoI, XhoI)	ניו אינגלנד Biolabs Inc.	R3193S/R0146S
Wizard SV ג'ל וערכת ניקוי PCR	Promega	A9282	250 rxn
Monarch	England Biolabs Inc.	#T1020S	עבור 50 rxn
GeneJet פלסמיד Miniprep ערכת	Thermo Scientific	K0503	עבור 250 rxn
GoTaq G2 DNA פולימראז	Promega	M7841
24-בארות שחור sensoplate עם תחתית זכוכית	Greiner Bio One	662892
FLUOStar קורא צלחת אומגה	BMG Labtech
OPTIMA / Mars ניתוח תוכנה	BMG Labtech		גרסה 2.20
Microsoft Excel 2010	Microsoft
Multitron Standard Incubator Shaker	Infors AG

עבור ערכת מיצוי ג'ל DNA New