גידול חיידקי מגנטוספירילום והערכת התנהגותם המגנטוטקטית

תקציר

מקור: Le Nagard, L., et al. גידול חיידקים מגנטוטקטיים מהסוג Magnetospirillum: זנים MSR-1, AMB-1 ו-MS-1. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים כיצד לתרבית חיידקי Magnetospirillum בתנאים מיקרואירוביים באמצעות מדיה נוזלית וחצי מוצקה כאחד. הוא מדגיש את היווצרות רצועת חיידקים גלויה בממשק החמצוני-אנוקסי ואת נדידתו כלפי מעלה כאשר החמצן מתרוקן. הסרטון מראה גם כיצד להעריך התנהגות מגנטוטקטית על ידי התבוננות בשחייה כיוונית בתגובה לשדה מגנטי.

פרוטוקול

1. חיסון של חיידקים מגנטוטקטיים (MTB)

הערה: ניתן להשיג את התרביות של הזנים AMB-1, MS-1 ו-MSR-1 באופן מסחרי (טבלת חומרים).

זהירות: בצע את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים, תחת להבה של מבער בונסן.

1. חיסון הזנים MSR-1, AMB-1 ו-MS-1 בנוזל בינוני
   1. אטום בקבוק סרום ריק של 125 מ"ל עם פקק בוטיל-גומי ואטם מלחץ אלומיניום. הכנס שתי מחטים לבקבוק דרך הפקק, וחבר מזרק לאחת מהן. חבר את המזרק לצילינדר של O₂ דרך אותו סוג צינור כמו זה המשמש לתחנת N₂.
   2. הניחו ל-O₂ לזרום דרך הבקבוק למשך כ-30 דקות כדי להבטיח שכל האוויר בבקבוק יוחלף ב-O₂. הסר את שתי המחטים, מה שמאפשר לחץ יתר קל בבקבוק, ולאחר מכן חיטוי. הניחו לבקבוק להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
      הערה: כדי לחסוך זמן, בצע את שלבים 1.1.1 ו-1.1.2 במהלך ההכנה הבינונית ובצע חיטוי של הבקבוק יחד עם המדיום או תמיסות המלאי.
   3. עקר את החלק העליון של הפקקים הן של הבקבוק הבינוני הטרי והן של בקבוק ה-O₂ על ידי מריחת כמה טיפות של תמיסת אתנול 70% מעליהם והעברתן דרך הלהבה של מבער בונסן .
   4. בעזרת מזרק סטרילי ומחט מחלצים 1 מ"ל של O₂ מבקבוק O₂ ומעבירים אותו לבקבוק הבינוני הטרי. ודא שהמחט מתאימה היטב למזרק במהלך שלב זה כדי למנוע אוויר במזרק.
   5. אם משתמשים בחיסון מתרבית אחרת שגדלה בבקבוק זכוכית, יש לעקר את הפקקים הן של הבקבוק הבינוני הטרי והן של בקבוק התרבית הישן יותר על ידי מריחת כמה טיפות של תמיסת אתנול 70% מעליהם והעברתן דרך הלהבה של מבער בונסן. אם משתמשים בחיסון מצינור של תרבית קפואה, פשוט תנו לו להתחמם לטמפרטורת החדר כשהצינור אטום מתחת ללהבה של מבער בונסן
   6. אם משתמשים בחיסון מתרבות אחרת שגדלה בבקבוק זכוכית, יש לחסן 1 מ"ל מהתרבית הישנה למדיום הטרי. אם משתמשים בחיסון מציר קפוא, יש לחסן רק 0.1 מ"ל כדי לדלל את הגליצרול או הדימתיל סולפוקסיד (DMSO) המשמשים בתהליך ההקפאה. בשני המקרים, השתמש במחט סטרילית ובמזרק סטרילי.
   7. דגרו את התרבית בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס וחסנו אותה למדיום טרי לאחר 4 עד 7 ימים.
2. חיסון של MSR-1 בשיפוע O₂ בינוני מוצק למחצה
   1. ודא שהשפופרת של מדיום טרי מציגה ממשק חמצני-אנוקסי מוגדר היטב (OAI), המתממש על ידי ממשק ורוד לחסר צבע.
   2. אם החיסון מגיע מתרבית חצי מוצקה אחרת בריכוז O₂, קצור את החיידקים על ידי פיפטינג של 50 מיקרוליטר מהתרבית עם קצה פיפטה סטרילי המונח על הרצועה שנוצרה על ידי החיידקים. חסנו לאט את החיידקים הללו ב-OAI במדיום הטרי (ממשק ורוד/חסר צבע), הימנעו מהפרעה לממשק. אם החיסון מגיע מתרבית קפואה, המשך באותו אופן עם 100 מיקרוליטר חיסון במקום זאת.
   3. אטמו את הצינור ותנו לחיידקים לגדול בין 25 מעלות צלזיוס ל-30 מעלות צלזיוס. העבירו למדיום טרי באותו הליך לפני שרצועת החיידקים מגיעה לפני השטח של המדיום.

2. התבוננות בחיידקים

1. עקרו את פקק בקבוק התרבות על ידי מריחת תמיסת אתנול 70% מעליו והעברתו דרך הלהבה של מבער בונסן . לקבלת מדיום מוצק למחצה, פתח את הצינור מתחת ללהבה של מבער בונסן. השתמש במחט סטרילית ובמזרק סטרילי כדי לחלץ את החיידקים.
2. השתמש בשיטת הטיפה התלויה8 כדי להבטיח שהחיידקים הם גם מגנטיים וגם תנועתיים.
   הערה: מיקרוסקופ ניגודיות פאזה נותן תוצאות נהדרות, אך אינו חובה. הגדלות הנעות בין 10X ל-60X מתאימות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
AMB-1	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 700264
MS-1	ATCC ATCC	31632
MSR-1	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)	DSM 6361
L-cysteine.HCl.H₂O	סיגמא-אולדריץ'	C7880-100 גרם
1.0 מ"ל מזרקים	פישר B309659
25 גרם x 1 מחטים	BD	305125
125 מ"ל בקבוקי סרום	וויטון	223748
20 מ"מ אטמי אלומיניום	Wheaton	224223-01
20 מ"מ E-Z Crimper	Wheaton	W225303
פקקי גומי בוטיל	Bellco Glass, Inc.	2048-11800
צינורות Hungate	Chemglass (VWR)	CLS-4208-01
פקק מחיצה, 13 מ"מ, Hungate	Bellco Glass, Inc.	2047-11600
צינורות תרבית זכוכית	קורנינג (VWR)	9826-16X

מדעי