שיטת מיקרו-דילול מרק לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה של חיידקים גראם חיוביים

Abstract

מקור: Koeth, L. M., et. al., A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing של חיידקים הגדלים באופן אירובי. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים את שיטת מיקרו-דילול המרק לקביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של אנטיביוטיקה ליפוגליקופפטיד כנגד חיידקים גראם חיוביים. הוא מכסה בידוד מושבות חיידקים, דילול, חיסון בארות מיקרו-צלחת עם ריכוזי אנטיביוטיקה משתנים, ואימות טוהר התרבית וספירת התאים. הסרטון גם מסביר כיצד קשירת אנטיביוטיקה משבשת את סינתזת דופן התא, מה שמוביל לליזה, וכיצד לזהות את ה-MIC על סמך עיכוב גדילה נראה.

Protocol

1. הכן דילול פאנל MIC

1. הכן תמיסת מלאי שאינה גבוהה מ-1,600 מיקרוגרם/מ"ל של dalbavancin בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) מסודר (טהור) בצינורות זכוכית או פלסטיק סטריליים, והשתמש באותו יום הכנה או אחסן בטמפרטורה של -20 עד -60 מעלות צלזיוס ומטה לשימוש עתידי במקפיא שאינו מפשיר. קח בחשבון את העוצמה של dalbavancin כפי שמופיע בתיעוד שהתקבל עם האבקה בעת שקילת האבקה.
2. מדללים את דילול המלאי בדומה לתוכנית עם DMSO מסודר בצינורות זכוכית או פלסטיק סטריליים. השתמש בפיפט אחד למדידת מדלל ובפיפט אחר להוספת מלאי הדלבנצין הראשוני לצינור הראשון. עבור כל ריכוז מלאי dalbavancin עוקב השתמש בפיפט חדש.
3. הכן דילול ריכוז פאנל MIC סופי פי 100 (ריכוזי ביניים) עם DMSO מסודר. שלב נפחים מתאימים של מקור ו-DMSO כדי להשיג ריכוז ביניים רצוי (הנפחים שישמשו יהיו תלויים במספר לוחות ה-MIC שייוצר).
4. הכן 0.004% P80: הכן תמיסת מלאי עבודה טרייה של 2% P80 על ידי הוספת 0.1 מ"ל P80 עד 4.9 מ"ל dH₂O. עקר על ידי מעבר דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר והשתמש בתמיסה באותו יום הכנה. הכן מדלל 0.004% P80 על ידי ביצוע דילול של 1:500 של 2% P80 (למשל, 0.3 מ"ל של 2% P80 עד 149.7 מ"ל של CAMHB).
5. יתר על כן, יש לדלל את ריכוזי הביניים של 1:100 במרק מולר הינטון מותאם לקטיונים (CAMHB) בתוספת 0.004% (v/v) פוליסורבט-80 (P-80) ו/או LHB (לסטרפטוקוקים) שנוספו בריכוז כפול מהסופי מכיוון שתוספת החיסון תביא לדילול של 1:2.

2. הכן לוחות MIC

1. הוצא 50 מיקרוליטר מכל תמיסת dalbavancin שהוכנה לבארות מתאימות של לוח ה-MIC וכלול מדיה רק בבאר אחת (באר בקרת גדילה). ניתן להשתמש בפיפטה רב ערוצית עם קצות סטריליות לשלב זה.
2. השתמש מיד בפאנלים או אטום בניילון פלסטיק, הניח אותם בשקיות ניילון והכניס מיד למקפיא שאינו מפשיר בטמפרטורה של ≤-20 מעלות צלזיוס (רצוי ב-≤-60 מעלות צלזיוס) עד הצורך. אם משתמשים בפאנלים קפואים, הסר אטמים והנח לוחות בודדים על ספסל המעבדה למשך 15-30 דקות (עד להפשרת תכולת הבאר) לפני שתמשיך בחיסון הפאנל.

3. חיסון לוחות MIC, ביצוע טוהר והגדר ספירת מושבות

1. בחר מספר מושבות מבודדות היטב מאגר דם של 18-24 שעות או צלחת אגר לא סלקטיבית אחרת. גע בחלק העליון של כל מושבה עם לולאה או ספוגית סטרילית והעביר ל-1-5 מ"ל CAMHB או מי מלח עד שהעכירות שווה ערך לתקן מקפרלנד 0.5. הערכת עכירות על ידי השוואה חזותית ל-0.5 McFarland או עם מכשיר פוטומטרי.
2. תוך 15-30 דקות מההכנה, יש לדלל את החיסון 1:100 ב-CAMHB (100 מיקרוליטר ל-10 מ"ל CAMHB). עבור רוב החיידקים שנבדקו כנגד dalbavancin, למעט S. pneumoniae, דילול זה יספק ריכוז באר סופי של 5 × 10⁵ CFU/mL (הטווח המקובל הוא 2-8 ×-10⁵ CFU/mL). עבור S. pneumoniae, ריכוז החיידקים המבוסס על השוואת עכירות ל-0.5 McFarland הוא בדרך כלל נמוך משמעותית. לכן, יש לדלל את החיסון 1:25 (400 מיקרוליטר ל-10 מ"ל CAMHB + 10% LHB).
3. תוך 15 דקות לאחר הכנת החיסון, העבירו 50 מיקרוליטר מהחיסון הסופי לכל באר (למעט באר בקרת הסטריליות) של לוח המיקרופון שהוכן. ניתן להשתמש בפיפטה רב-ערוצית באמצעות קצות סטריליות לשלב זה.
4. בצע בדיקת טוהר על ידי העברה ופיזור של 1-10 מיקרוליטר מבאר בקרת הצמיחה החיובית באמצעות לולאה סטרילית לאגר לא סלקטיבי (למשל, אגר סויה טריפטיקאז עם 5% דם כבשים).
5. הגדר את ספירת המושבה על ידי הוצאת 10 מיקרוליטר מבאר בקרת הגידול עם פיפטה חד-ערוצית וקצה סטרילי והעברה ל-10 מ"ל מי מלח (דילול של 1:1,000). מערבבים ומעבירים 100 מיקרוליטר עם פיפטה חד-ערוצית וקצה סטרילי למדיום אגר לא סלקטיבי מתאים (למשל, אגר סויה טריפטיקאז עם 5% דם כבשים) ומורחים על פני כל משטח האגר עם לולאה סטרילית, חוזרים על עצמם פעמיים בכיוונים שונים כדי להבטיח פיזור אחיד של החיסון (דילול 1:10).

4. דגירה של לוחות MIC, ספירת מושבות וצלחות טוהר

1. אטום כל לוח MIC או ערימה של לא יותר מארבעה לוחות בשקית ניילון עם סרט פלסטיק או עם כיסוי פלסטיק הדוק לפני הדגירה. לחלופין, הנח לוח MIC ריק בחלק העליון של הערימה של לא יותר מ-4 לוחות MIC, הנח מגבת נייר לחה במיכל פלסטיק, הנח לוחות MIC במיכל הפלסטיק וסגור את המיכל היטב עם מכסה. דגרו לוחות MIC בחממת אוויר סביבתית בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס ± 2 מעלות צלזיוס למשך 16-20 שעות (סטפילוקוקים ואנטרוקוקים) ו-20-24 שעות (סטרפטוקוקים) תוך 30 דקות מהחיסון. דגרו את ספירת המושבה ואת לוחות הטוהר באותם תנאים, למעט דגירה של סטרפטוקוק בחממה של 5% CO₂.

5. קרא את לוחות ה-MIC ו-Colony Count; בדוק את לוחית הטוהר

1. קרא את המיקרופון כריכוז הנמוך ביותר המעכב לחלוטין את צמיחת החיידקים בבארות כפי שזוהה על ידי עין בלתי.
2. ספור מושבות בלוחית ספירת המושבות. הכפילו כל מושבה במקדם הדילול (1:10,000) (למשל, 50 מושבות שוות ערך ל-5 ×-10⁵ CFU/mL). טווח מקובל הוא 20-80 מושבות (2-8 ×-10⁵ CFU/mL) ומשמש כקו מנחה משוער.
3. בדוק את לוחית הטוהר. אם כל המושבות דומות לכל מושבה, אז החיסון יכול להיחשב טהור. אם קיימות מושבות אחרות, אז יש פוטנציאל לנוכחות מזהם בפאנל המיקרופון, ויש לחזור על הבדיקה.

Materials