הדמיה בתיווך ננו-חלקיקים של שיפוץ אנדו-ליזוזומלי בתאים נגועים בחיידקים

תקציר

מקור: Zhang, Y., et al. יישום של ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים לחקר שיפוץ המערכת האנדו-ליזוזומלית על ידי חיידקים תוך-תאיים. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את השימוש בננו-חלקיקים פלואורסצנטיים כדי להמחיש שיפוץ אנדו-ליזוזומלי בתאי אפיתל אנושיים הנגועים בחיידקים תוך-תאיים. בעקבות פלישת חיידקים, הפתוגנים מתמרנים את השלד הציטולוגי המארח ואת המערכת האנדו-ליזוזומלית, ויוצרים ואקואולים עם הקרנות צינוריות המשנות את הובלת השלפוחית. לאחר מכן משתמשים בננו-חלקיקים בעלי תווית פלואורסצנטית כדי לעקוב אחר שינויים אלה, מה שמאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של אירועי סחר תוך-תאיים הנגרמים על ידי פתוגנים.

פרוטוקול

1. תרבית של תאי HeLa
   1. תאי HeLa המבטאים באופן קבוע LAMP1-GFP (גליקופרוטאין ממברנה הקשור לליזוזום 1-חלבון פלואורסצנטי ירוק) מתורבתים במדיום הנשר המותאם של Dulbecco, או DMEM עם 10% סרום עגל עוברי (FCS) וגדלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה המכילה 5% CO₂.
   2. זרעו את התאים בצפיפות של 50,000 לבאר במגלשה של 8 בארות (איבידי) ודגרו למשך הלילה (O/N).
2. תרבית של חיידקים
   1. השתמש בזן Salmonella enterica serovar Typhimurium NCTC 12023 wild-type (WT). לשם השוואה, השתמש בזנים מוטנטיים ΔssaV פגומים ב-SPI2-T3SS ו-ΔsifA חסר אפקטור מפתח SifA עבור SIF. השתמש בזנים המכילים פלסמיד pFPV25.1 לביטוי מכונן של GFP משופר.
      הערה: זני חיידקים מתורבתים באופן שגרתי במרק לוריא-ברטני (LB) בתוספת של 50 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין (WT) ו-LB בתוספת של 50 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין ו/או 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין (ΔssaV, ΔsifA) של הנדרש לשמירה על פלסמידים.
   2. יש לחסן מושבה בודדת של חיידקים ב-3 מ"ל LB עם אנטיביוטיקה מתאימה ולגדל O/N ב-37 מעלות צלזיוס בתנאי טלטול לאוורור, ואז לדלל 1:31 ב-LB טרי ולהמשיך בצמיחה למשך 3.5 שעות. בנקודת זמן זו, התרביות מגיעות לשלב הבול המאוחר והחיידקים פולשניים מאוד. 'תוף רולר' נוח לדגירת תרביות מבחנה עם אוורור.
3. זיהום של תאי HeLa על ידי ננו-חלקיקי סלמונלה וזהב-BSA-רודמין או תיוג NPs Pulse Chase (ראה איור 1 לסכימה)
   1. למדוד OD₆₀₀ של החיידקים התת-מתורבתים ולדלל ל-OD₆₀₀ = 0.2 ב-1 מ"ל תמיסת מלח עם חוצץ פוספט או PBS (~3 × 10⁸ cfu/ml), הוסף כמויות מתאימות של חיידקים לתאי HeLa בשקופיות תא של 8 בארות כדי להשיג ריבוי זיהום (MOI) של 100.
   2. יש לדגור במשך 30 דקות בחממת התאים, לשטוף 3 פעמים עם PBS כדי להסיר חיידקים לא מופנמים (נקודת זמן זו נקבעה כ-0 שעות לאחר ההדבקה, או 0 שעות p.i). יש להוסיף 300 מיקרוליטר של תרבית טרייה המכילה 100 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין ולשמור למשך שעה. לאחר מכן החלף את המדיום במדיום טרי המכיל 10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין למשך שארית זמן הדגירה.
   3. לאחר דגירה עם מדיום תרבית המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין למשך שעה, המדיום מוחלף במדיום הדמיה (MEM של Eagle's ללא FCS, L-גלוטמין, פנול אדום ונתרן ביקרבונט, עם 30 מ"מ HEPES, pH 7.4) המכיל 10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין. NPs זהב-BSA-רודמין מתווספים לתאי HeLa כדי לקבל ריכוז סופי של OD₅₂₀ = 0.1. (אלבומין בסרום בקר, או BSA)
      הערה: ניתן להוסיף NPs זהב-BSA-רודמין לתאים גם לפני ההדבקה, או בנקודות זמן שונות p.i.
   4. לאחר שעה אחת של דגירה, הסר את המדיום, שטוף 3 פעמים עם PBS והוסף 300 מיקרוליטר של מדיום הדמיה טרי המכיל 10% FCS ו-10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין למשך שארית זמן הדגירה.
      הערה: משך הדגירה עשוי להשתנות בהתאם לריכוז ה-NPs וקווי התאים המשמשים. עבור מקרופאגים RAW264.7, ראינו כי דגירה של 30 דקות עם NPs בריכוז של OD₅₂₀ = 0.05 אפשרה הפנמה מספקת.

תוצאות

איור 1. תוכנית להכנת תאי HeLa להדמיית תאים חיים. תאי HeLa נזרעו במגלשות תאיות, נדבקו או נדבקו בזני סלמונלה שונים למשך 30 דקות, נשטפו 3 פעמים עם PBS, ולאחר מכן הודגרו במדיום המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין למשך שעה. לאחר מכן, המדיום הוח...

חומרים