גידול Mycobacterium tuberculosis בתנאים מוגבלים בברזל

תקציר

מקור: Gupta, S., et al. בידוד ואפיון שלפוחיות חוץ-תאיות המיוצרות על ידי מיקובקטריות מוגבלות בברזל. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את ההליך לתרבית Mycobacterium tuberculosis בתנאים מוגבלים בברזל כדי לגרום ללחץ ברזל ולקדם הפרשת סידרופורים התומכים בהישרדות חיידקים.

פרוטוקול

1. גידול מיקובקטריות בתנאים מוגבלים בברזל

1. יש להפשיר 50 מיקרוליטר של מלאי גליצרול קפוא של 15% גליצרול של Mtb (Mycobacterium tuberculosis) ולפס צלחת אגר בתוספת העשרה של 10% ADN (אלבומין – דקסטרוז – NaCl) (5 גרם/ליטר אלבומין, 2 גרם/ליטר דקסטרוז ו-0.85 גרם/ליטר נתרן כלורי, 0.2% גליצרול ו-0.05% טווין-80). דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למראה מושבות.
2. לחסן מושבה אחת של Mtb ב-2 מ"ל של מצע מרק מיקובקטריאלי (טבלת חומרים) בתוספת העשרת ADN. יש לדגור עם תסיסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
3. תן לתרבית Mtb לגדול לשלב הלוגריתמי המאוחר (OD₅₄₀ הוא ~0.8). כדי לבדוק זאת, מדוד את ה-OD₅₄₀ באמצעות ספקטרופוטומטר.
4. מורחים 200 מיקרוליטר מהתרבית הלוגריתמית המאוחרת על צלחות אגר מיקובקטריאליות (טבלת חומרים) בתוספת 0.2% גליצרול, 0.05% טווין-80 ו-ADN. לחסן לפחות 5 צלחות. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שצמיחת חיידקים נראית כשכבה מתכנסת. זה לוקח ~ שבוע אחד ל-Mtb.
5. הרטיבו צמר גפן סטרילי ב-LIMM (מדיום מינימלי דל ברזל). השתמש בספוגית זו כדי לאסוף חיידקים מצלחות האגר ולחסן 100 מ"ל של LIMM להכנת תרחיף חיידקים מרוכז עם OD₅₄₀ של ~1.0.
6. יש לדלל תרחיף זה 10 פעמים ל-1 ליטר עם LIMM ולחלק אותו לשני בקבוקי פלסטיק סטריליים בנפח 2 ליטר, שכל אחד מהם מכיל 500 מ"ל תרבית.
7. מוציאים 2 מ"ל תרבית ומעבירים אותה לצינור תרבית של 5 מ"ל. הוסף 10 מיקרוליטר של 10% נפח/נפח tyloxapol.
8. דגרו על התרבויות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 14 יום.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מידלברוק 7H10 אגר	BD דיפקו	262710	צלחות אגר מיקובקטריאליות
מרק מידלברוק 7H9	BD דיפקו	271310	מדיום מרק מיקובקטריאלי
צינור צנטריפוגה דק דופן פוליפרופילן 13x15 מ"מ	בקמן קולטר	344059	צינור צנטריפוגה דק דופן פוליפרופילן 13x15 מ"מ
צלוחיות סינון ואקום	סלפרו	V50022	יחידת סינון