בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות המכילות סידרופור מ-Mycobacterium tuberculosis

תקציר

מקור: גופטה, ס., מרסלה רודריגז, ג. בידוד ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות המיוצרות על ידי מיקובקטריות מוגבלות בברזל. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את הבידוד ההדרגתי של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Mycobacterium tuberculosis שגודלו בתנאים מגבילים של ברזל המחקים את הסביבה המארחת. הוא מתאר את השימוש באולטרה-סינון, צנטריפוגה דיפרנציאלית והפרדת שיפוע צפיפות כדי להעשיר ולזהות שברים המכילים EV.

פרוטוקול

1. אוסף שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות (MEVs)

1. מדוד את ה-OD₅₄₀ של תרבית 2 מ"ל בזמן האיסוף. בצע דילולים סדרתיים של 1:10 של התרבית וצלחת 100 מיקרוליטר מכל דילול על לוחות אגר עם ADN ו-0.05% טווין-80.
2. העבירו את התרבית לחמישה צינורות צנטריפוגה חרוטיים של 225 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 2,850 x גרם למשך 7 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
3. אוספים את חומר העל של התרבית עם פיפטה של 50 מ"ל ומעקרים אותו דרך יחידת סינון של 0.22 מיקרומטר.

2. בידוד של MEV

1. העבירו את תסנין התרבית למערכת אולטרה-סינון תאים מעורבבים הממוקמת ב-4 מעלות צלזיוס וסננו את התרכיז ב-<50 psi דרך קרום חיתוך של 100 kDa ל-~50 מ"ל.
2. צנטריפוגה התרבות המרוכזת מסננת ב-15,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ואוספת את הסופרנטנט.
3. צנטריפוגה תסנין התרבית בצינורות אולטרה-צנטריפוגה מפוליקרבונט ב-100,000 x גרם למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.
4. השעו מחדש את הכדורים הקרומיים בסך הכל 1 מ"ל של מי מלח סטריליים עם חוצץ פוספט (PBS) על ידי פיפטינג עדין.
5. יש לערבב 0.5 מ"ל מתרחיף הגלולה שהתקבל בשלב 2.4 עם 1.5 מ"ל של תמיסת יודיקסנול 60%, ומניב ריכוז יודיקסנול סופי של 45% משקל/נפח. הוצא תערובת זו בתחתית צינור אולטרה-צנטריפוגה בעל דופן דקה מפוליפרופילן בגודל 13 מ"מ על 51 מ"מ.
6. שכב על תרחיף MEV-iodixanol 45% עם 1 מ"ל של 40%, 35%, 30%, 25% ו-20% (נפח/נפח ב-PBS) תמיסות יודיקסנול ו-1 מ"ל של PBS בחלק העליון.
7. צנטריפוגה ב-100,000 x גרם למשך 18 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
8. אסוף את שברי שיפוע הצפיפות של 1 מ"ל החל מלמעלה באמצעות מזרק המילטון של 1 מ"ל.
9. יש לדלל כל חלק שנאסף ל-20 מ"ל עם PBS וצנטריפוגה ב-100,000 x גרם למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.
10. הסר את הסופרנטנט והשהה את הגלולה ב-0.5 מ"ל PBS. יש לאחסן את הגלולה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

חומרים