סרטון זה מדגים את הבידוד והריכוז של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שמקורן בקרום החיצוני של חיידקים מהונדסים גנטית. התהליך כולל גידול החיידקים לשחרור EVs, ואחריו צנטריפוגה עוקבת ושלבי סינון להסרת תאים ופסולת. לבסוף, אולטרה-סינון משמש לריכוז הרכבים החשמליים לניתוח במורד הזרם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד והעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בקרום החיצוני מחיידקים
1.1K צפיות
⸱
26 בספטמבר 2025
במאמר זה
תקציר
פרוטוקול
1. זני חיידקים ותנאי תרבות
הערה: זני חיידקים ששימשו במחקר זה היו Escherichia coli MP1, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve ו-Bifidobacterium dentium.
1. עבור E. coli, השתמש בלולאה סטרילית כדי לחסן מושבות בודדות לתוך 250 עד 1,000 מ"ל של מרק לוריא-ברטאני (LB) ולדגור באופן אירובי בחממה רועדת ב-300 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפני עיבוד התרבית. עבור זן E. coli MP1 רקומביננטי המכיל p114-mCherryClyluc, הוסף כלורמפניקול לאגר LB ולמרק בריכוז סופי של 17 מיקרוגרם/מ"ל.
2. עבור A. mucinophila, <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מכסה שטוח 0.5 מ"ל, צינורות PCR דקי דופן | תרמו סיינטיפיק | 3430 | חשוב להשתמש בצינורות PCR בעלי קירות דקים כדי לקבל קריאות מדויקות עם Qubit |
| תמיסה מימית של 16% פרפורמלדהיד (פורמלדהיד) | מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים | 15700 | |
| 250 מ"ל בקבוקי צנטריפוגה מפוליפרופילן Fiberlite | תרמו-פישר | 010-1495 | |
| 500 מ"ל בקבוקי צנטריפוגה מפוליפרופילן Fiberlite | תרמו-פישר | 010-1493 | |
| מתאם בקבוק פוליפרופילן 65 מ"מ עם תחתית עגולה/חרוטית | בקמן קולטר | 392077 | מאפשר ל-Vivacell להיכנס לרוטור |
| Akkermansia mucinophila | ATCC | BAA-835 | |
| Amicon-15 (100 kDa MWCO) | מיליפורסיגמא | UFC910024 | |
| צנטריפוגה Avanti J-20 XPI | בקמן קולטר | כבר לא נמכר על ידי בקמן. אוונטי J-26XP הוא הדגם העכשווי הקרוב ביותר. | |
| בקטרואידס תטאיוטאומיקרון VPI 5482 | ATCC | 29148 | |
| ביפידובקטריום ברווה | NCIMB | B8807 | |
| ביפידובקטריום דנטיום | ATCC | 27678 | |
| מרק עירוי לב מוח (BHI) | היימדיה | M2101 | לאחר החיטוי, גם מרק BHI וגם אגר הוכנסו לתא האנאירובי, בתוספת מנדיון (1 מיקרוגרם/ליטר), המטין (1.2 מק"ג/ליטר) ו-L-ציסטאין הידרוכלוריד (0.05%). לאחר מכן הם הודגרו במשך 24 שעות לפחות בתנאים אנאירוביים לפני החיסון בזני החיידקים האנאירוביים. |
| מחסנית מיקרופלואידיקה C-300 | ספקטרדין | ||
| כלורמפניקול | MP ביומדיקל | ICN19032105 | |
| Escherichia coli HST08 (תאים מוכשרים של סטלר) | טאקארה | 636763 | |
| Escherichia coli MP1 | ד"ר מארק גוליאן (מתנה) | חיידקים קומנסליים שמקורם במעיים של עכברים | |
| מתאם Fiberlite 500 מ"ל עד 250 מ"ל | תרמו-פישר | 010-0151-05 | משמש עם רוטור Fiberlite כדי לאפשר שימוש בבקבוקים של 250 מ"ל לגודל קטן יותר של התחלת תרבית חיידקים |
| רוטור צנטריפוגה בזווית קבועה של Fiberlite | תרמו-פישר | F12-6x500-LEX | מתאים לבקבוקים של 6 x 500 מ"ל |
| מרק לאוריה ברטאני, מילר | דיפקו | 244620 |
