$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. זני חיידקים ותנאי תרבות
הערה: זני חיידקים ששימשו במחקר זה היו Escherichia coli MP1, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve ו-Bifidobacterium dentium.
1. עבור E. coli, השתמש בלולאה סטרילית כדי לחסן מושבות בודדות לתוך 250 עד 1,000 מ"ל של מרק לוריא-ברטאני (LB) ולדגור באופן אירובי בחממה רועדת ב-300 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפני עיבוד התרבית. עבור זן E. coli MP1 רקומביננטי המכיל p114-mCherryClyluc, הוסף כלורמפניקול לאגר LB ולמרק בריכוז סופי של 17 מיקרוגרם/מ"ל.
2. עבור A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve ו- B. dentium, פס על צלחות אגר עירוי לב מוח (BHI) ודגירה אנאירובית בתוך תא ויניל אנאירובי. יש לחסן מושבות בודדות ל-100 מ"ל של מרק BHI מופחת מראש ולדגור למשך 48 שעות באופן אנאירובי.
2. בידוד EV
1. הבהרת מדיום תרבית חיידקים על ידי צנטריפוגה וסינון
1. העבירו את תרביות תאי החיידקים שחוסנו בשלב 1 לניקוי בקבוקי צנטריפוגה מפוליפרופילן של 250 מ"ל או 500 מ"ל על ידי מזיגה. צנטריפוגה את הבקבוקים ברוטור בעל קיבולת גדולה וזווית קבועה ב-4 מעלות צלזיוס ו-5,000 × גרם למשך 15 דקות. העבירו את הסופרנטנט לבקבוקי צנטריפוגה נקיים על ידי מזיגה זהירה, וצנטריפוגה שוב בחום של 10,000 × גרם למשך 15 דקות.
הערה: עשה שימוש חוזר בבקבוקים לאחר ניקוי וטיהור המתאימים לבטיחות ביולוגית.
1. אם קיימים כדורים גדולים של תאי חיידקים לאחר הצנטריפוגה השנייה, חזור על הצנטריפוגה בבקבוק נקי כדי להסיר תאים נוספים.
2. העבירו את הסופרנטנט למכשיר מסנן מונע ואקום פוליאתרסולפון בגודל מתאים בגודל מתאים על ידי מזיגה. סנן על ידי חיבור מכשיר הסינון לאספקת קיר ואקום. אם קצב הסינון יורד משמעותית, פשוט העבר כל חומר לא מסונן למכשיר חדש. אחסן את המדיום המסונן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה והמשך בפרוטוקול למחרת אם תרצה.
הערה: הצנטריפוגות לעיל מאפשרות בדרך כלל עיבוד של ~פי 2 מהנפח המצוין של תרבית תאים דרך כל מכשיר. לדוגמה, מכשיר סינון יחיד של 500 מ"ל יכול לסנן ~1,000 מ"ל של תרבית פרה-צנטריפוגה. בדרך כלל לא נעשה שימוש חוזר במכשירים אלה. השימוש במסנני מזרק בשלב זה אינו מומלץ ללא אופטימיזציה, מכיוון שהפסדים משמעותיים נרשמו בדגמים שנבדקו. זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית.
3. בדוק את ההסרה המלאה של התאים הקיימים בשלב זה על ידי פיזור מנה של הסופרנטנט המסונן על צלחות אגר מתאימות וודא היעדר מושבות לאחר הדגירה בתנאים אופטימליים לזן החיידקים. אם מתגלים חיידקים, בצע אופטימיזציה נוספת של ההליך לעיל על ידי ביצוע צנטריפוגות ו/או סינון נוספים.
2. ריכוז המדיום המסונן
1. אם עובדים עם נפחים משמעותיים >100 מ"ל, המשך לשלב 2.2.2. אם עובדים עם נפחים של ~100 מ"ל, טען 90 מ"ל של מדיום תרבית מסונן על המאגר של מכשיר אולטרה-סינון צנטריפוגלי בעל קיבולת מתאימה של 100 kDa (MWCO) באמצעות פיפטות סרולוגיות. איזון תמיד עם מכשיר אולטרה-סינון תואם, וצנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד ב-4 מעלות צלזיוס ו-2,000 × גרם למשך 15-30 דקות, עד שנפח המדיום במאגר העליון מרוכז ל-<0.5 מ"ל.
1. מלאו את המאגר בכל מדיום תרבית מסונן שנותר. אם "ממלאים", הסירו את הזרימה בתחתית המכשיר ואזנו מחדש את כל המכשירים.
הערה: נצפה כי הנפח המרבי של מדיום תרבית מסונן שניתן לרכז באמצעות מכשירים אלה הוא פי <פי 2 מהנפח המומלץ.
2. אם הצמיגות של המדיום המרוכז במאגר מוגברת באופן ניכר (חומר כהה וצמיג), יש לדלל במי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) ולרכז מחדש על ידי צנטריפוגה כדי לדלל כל חלבון שאינו EV קטן מה-MWCO של 100 kDa.
הערה: זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית.
3. העבירו את המדיום המרוכז לצינור קושר חלבון נמוך, אחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, והמשיכו בפרוטוקול למחרת אם תרצו.
2. אם עובדים עם נפחים משמעותיים >100 מ"ל, בחר מכשיר סינון זרימה משיקי (TFF) בגודל מתאים (100 kDa MWCO) כדי להתאים לנפח לעיבוד.
הערה: התקני סינון לעיבוד של 100 מ"ל עד >1,000 מ"ל זמינים מסחרית. זמינות מקומית, עלות ותאימות עם המשאבה והצינורות/חיבורים יכתיבו אילו דגמים מסוימים יהיו שימושיים ביותר. עד 2 ליטר של מדיום תרבית עובדו עם המכשיר המצוין בטבלת החומרים לפני הצורך לנקות את המסנן (ראה שלב 2.3 להלן לפרוטוקול הניקוי).
1. הרכיבו מעגל סינון עם צינורות #16 בעלי כריכה נמוכה/שטיפה נמוכה, מתאמי צינור 1/8 אינץ' ל-Luer, מכשיר TFF ומשאבה פריסטלטית.
הערה: בצע TFF בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי למזער את הסיכון לזיהום הכנת EV בחיידקים סביבתיים.
2. בטמפרטורת החדר, התחל להפיץ את המדיום המסונן והממוזג בכ-200 מ"ל/דקה (מינימום 100 מ"ל/דקה). קבע את הסל"ד המתאים המתאים לקצב הזרימה הרצוי על ידי שאיבת 200 מ"ל PBS לכלי מדורג. בעת מחזור מדיום מסונן וממוזג, אסוף את המולקולות <100 kDa החוצות את קרום האולטרה-סינון כפסולת בכלי נפרד.
הערה: הדוגמה שלהלן תניח נפח התחלתי של 2 ליטר תרבית.
3. המשך להפיץ את המדיום המותנה עד שנפחו יופחת ל ~ 100-200 מ"ל. עוברים לכלי שיט קטנים יותר לפי הצורך. מדללים פי 2 עם PBS, וממשיכים להסתובב עם המשאבה, תוך ריכוז עד 75-100 מ"ל. מדללים פי 2 עם PBS וממשיכים להסתובב לנפח סופי של 25 מ"ל. מדללים פי 2 עם PBS וממשיכים להסתובב עד <10 מ"ל.
4. הרם את צינור ההזנה ממאגר הדגימה והמשך לשאוב כדי לטהר את המסנן ולשחזר את הכמות המקסימלית של הדגימה.
הערה: זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית.
5. מעבירים את הדגימה המרוכזת לצינור חרוטי ומאחסנים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס אם רוצים. לחלופין, המשך עם הפרוטוקול.
6. העבר את המדגם המרוכז למכשיר אולטרה-סינון צנטריפוגלי של 15 מ"ל 100 kDa MWCO. צנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-2,000 × גרם למשך 15-30 דקות עד שנפח המדיום במאגר העליון מרוכז ל-<2 מ"ל.
הערה: זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית.
7. העבירו את המדיום המרוכז לצינור קושר חלבון נמוך, ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, והמשיכו את הפרוטוקול למחרת אם תרצו.