$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC)
הערה: SEC משמש להגברת הטוהר של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) ולהסרת חלבון שאינו שלפוחית.
- השתמש בעמודת SEC קטנה (נפח מיטה של 10 מ"ל) לבידוד רכבים חשמליים מ-<100 מ"ל של חומר התחלתי ובעמודה גדולה יותר (נפח מיטה של 47 מ"ל) לבידוד רכבים חשמליים מ->100 מ"ל של חומר התחלתי.
הערה: הדוגמה שלהלן תפרט אמצעי אחסון עבור העמודה הגדולה יותר, עם אמצעי אחסון עבור העמודה הקטנה יותר בסוגריים. - הביאו את עמודת ה-SEC ואת מי המלח עם חוצץ פוספט (PBS) לטמפרטורת החדר במשך מספר שעות. ייצב את עמוד ה-SEC במצב אנכי באמצעות מעמד ומחזיק מעבדה סטנדרטיים. לחלופין, השתמש במעמדי עמודים מסחריים של כרומטוגרפיה.
- לפני החיבור לעמודת ה-SEC, הרטיבו את מאגר הדגימה על ידי מתן אפשרות ל-5 מ"ל של PBS לזרום דרך הפריט ולתוך מיכל פסולת. הברג את מכסה הכניסה של עמודת ה-SEC, הוסף 2 מ"ל של PBS למאגר המדגם, וחבר בזהירות את המאגר לעמודה כאשר ה-PBS מטפטף החוצה דרך הפריט (לא ישים עבור עמודות SEC קטנות). הערה: שלב קודם זה מונע מבועות אוויר להילכד בחלק העליון של עמודת ה-SEC. אם אוויר נלכד, הסר את המאגר, הקש על העמוד כדי להוציא את בועת האוויר החוצה וחזור על הליך החיבור. עבור העמודה הקטנה יותר, פשוט פתח את המכסה של החלק העליון של עמודת ה-SEC וחבר את הופר הדגימה.
- הוסף 47 מ"ל (10 מ"ל) של PBS למאגר הדגימה ופתח את המכסה של החלק התחתון של עמודת ה-SEC. אפשר לכל מאגר הדגימה שנטען לזרום דרך העמודה לצורך שיווי משקל. השליכו את הזרימה.
- טען מקסימום 2 מ"ל (0.5 מ"ל) של דגימה על מאגר הדגימה, השליך את הזרימה ואפשר לדגימה להיכנס לעמודה לחלוטין.
- הוסף מיד PBS למאגר הדגימה או למיכל בנפח של 14.25 מ"ל פחות נפח הדגימה (3 מ"ל פחות נפח הדגימה, עבור העמודה הקטנה). אפשר לפתרון לזרום דרך העמודה ולמחוק כמות זו השווה לנפח הריק.
הערה: עבור דגימה טיפוסית של 2 מ"ל, כמות ה-PBS שתתווסף למאגר הדגימה או להופר תהיה 12.25 מ"ל. - מקם מיקרו-צינור בעל כריכה נמוכה של 2 מ"ל ישירות מתחת לעמודת ה-SEC. הוסף מיד 2 מ"ל (0.5 מ"ל) של PBS למאגר הדגימה ואפשר לו להיכנס לעמודה. סמן את 2 המ"ל הראשונים (0.5 מ"ל) של זרימה כשבר 1. המשך להוסיף 2 מ"ל (0.5 מ"ל) בכל פעם למאגר הדגימה כדי לאסוף כל שבר שלאחר מכן.
הערה: רוב ה-EVs החיידקיים מתפוגגים ב-5 השברים הראשונים. במהלך האופטימיזציה, נאספו 12 השברים הראשונים. - אחסן את השברים ב-4 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר (ימים) או -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.