זיהום חיידקי במבחנה של תאי T באמצעות היווצרות סינפסה אימונולוגית

תקציר

מקור: Cruz-Adalia, A., et al. תאי T לוכדים חיידקים על ידי זיהום מתאים דנדריטיים. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים טרנס-זיהום חיידקי באמצעות אינטראקציות ספציפיות לאנטיגן בין תאי T לתאים דנדריטיים. תאים דנדריטיים נגועים בחיידקים המציגים פפטיד אובאלבומין מודגרים עם תאי T, ישירות או מופרדים על ידי ממברנה. מגע ישיר מאפשר היווצרות סינפסות אימונולוגיות, המאפשרת העברת חיידקים, בעוד הממברנה מונעת אינטראקציה. לאחר מכן נעשה טיפול בגנטמיצין כדי לחסל חיידקים חוץ-תאיים.

פרוטוקול

הערה: עכברים גודלו בבית נטול פתוגנים ספציפיים (SPF) והם הומתו על ידי צוות מיומן ומוסמך בשיטת שאיפת פחמן דו חמצני (CO₂).
1. התמיינות וזיהום של תאים דנדריטיים (DCs) שמקורם במח עצם של עכברהערה: איור 1 מסכם את הצעד הראשון הזה. כל ההליכים צריכים להתבצע במכסה המנוע מנקודה זו ואילך, תוך שימוש רק במדיה סטרילית, מכשירים, קצות פיפטה וכלי תרבות.

1. התמיינות DCs שמקורה במח עצם עכבר
   1. נתחו את עצם השוק ועצם הירך מעכבר C57/BL6 אחד והעבירו אותם לכלי פלסטיק עם 10 מ"ל של מדיום מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI).
   2. חותכים כל אפיפיזה, בעזרת מספריים סטריליים וחושפים מח עצם, בעל צבע אדום בוהק אופייני.
   3. יש להחדיר לחלק הפנימי של העצם 10 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) המכיל 0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-5 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) (PBS/BSA/EDTA) באמצעות מזרק סטרילי על צלחת פטרי סטרילית.
   4. אוספים את תרחיף התאים והצנטריפוגה בצינור בטמפרטורה של 600 x גרם בצנטריפוגה מקוררת (4 מעלות צלזיוס).
   5. השעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מאגר ליזה אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) (0.15 מ"מ אמוניום כלוריד (NH₄Cl), 10 מ"מ אשלגן ביקרבונט (KHCO₃) ו-0.1 מ"מ EDTA) ודגרו למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר (RT) על מנת לחסל כדוריות דם אדומות.
   6. הוסף 10 מ"ל של מדיום RPMI 1640 עם סרום בקר עוברי 10% (FBS) וסנן דרך מסננת תאים (70 מיקרומטר) כדי להסיר שברי עצם וגושי תאים לפני צנטריפוגה באותה מהירות (600 xg) מכיוון שגושים חוסלו על ידי סינון.
   7. ספרו את התאים והתאימו ל-5 x 10⁵ תאים/מ"ל עם RPMI 10% FBS (המכיל 50 מיקרומטר B-מרקפטואתנול, 1 מ"מ נתרן פירובט) והוסיפו 20 ננוגרם/מ"ל רקומביננטי של גרנולוציטים-מקרופאגים (rm-GM-CSF) כריכוז סופי.
   8. הוסף תרחיף זה לאיכות סטרילית ומיקרוביולוגית, צלחת פטרי 15 ס"מ ותרבית בחממת CO₂ (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂).
   9. כל שלושה ימים, יש לסובב גם תאים שאינם נדבקים וגם תאים מנותקים עם 5 מ"מ EDTA ב-PBS ולהשעות מחדש בצפיפות תאים של 5 x 10⁵ תאים/מ"ל, עם מדיום טרי המכיל 20 ננוגרם/מ"ל rm-GM-CSF.
2. התבגרות DCs וטעינת אנטיגן
   1. ביום התשיעי יש להשעות את התאים בצפיפות של 5 x 10⁵ תאים/מ"ל במדיום המכיל 20 ננוגרם/מ"ל rm-GM-CSF. לאחר מכן, יש להוסיף 20 ננוגרם/מ"ל של ליפופוליסכריד (LPS) כדי לאפשר ביטוי גבוה של קומפלקס תאימות היסטולוגית או MHC-II על תאים ולדגור בצלחת פטרי סטרילית בגודל 15 ס"מ שאינה מטופלת בתרבית רקמות למשך 24 שעות.
   2. לאחר יום אחד של גירוי LPS, צבעו כמה תאי DC בנוגדנים כנגד CD11c, MHC-II וקולטן גרנולוציטים-1 או Gr-1 כדי לבדוק התמיינות DC על ידי ציטומטריית זרימה. דוגמה לניתוח ציטומטריית זרימה של DCs מוצגת באיורים 3A ו-3B.
      1. דגירה DCs (5 x 10⁵ תאים לדגימה) עם נוגדן חד שבטי נגד עכבר-CD16/CD32 בריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם/מ"ל במאגר PBS/BSA/EDTA של 50 מיקרוליטר לכל דגימה. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של הנוגדנים כנגד MHC-II (I-A/I-E), CD11c ו-Gr-1 מצומדים עם פלואורוכרומים שונים ב-1:100, 1:200 ו-1:500 במאגר PBS/BSA/EDTA, בהתאמה.
      2. לבסוף, שטפו DCs עם מאגר PBS/BSA/EDTA ונתחו לפי ציטומטריית זרימה בהתאם לפרוטוקול היצרן.
         הערה: אם התאים מובחנים היטב, הם מוכנים להעמסת אנטיגן.
   3. שטפו DCs עם RPMI 10% FBS (ללא אנטיביוטיקה) ודגרו אותם עם 10 מיקרוגרם/מ"ל פפטיד OTII של אובובאלבומין (OVAp) (OVA 323-339; I S Q A V H A A H A E I N E E G R) על צינור פלסטיק ב -1 מ"ל של RPMI 10% FBS בינוני לכל 5 x 10⁶ DCs למשך מינימום שעה אחת ב -37 מעלות צלזיוס. כבקרה שלילית, השאירו DCs מבלי לדגור עם OVAp.
3. זיהום של DCs
   1. להדביק DCs בריבוי זיהום (MOI) של 10 חיידקים (10 חיידקים לכל DC) למשך שעה אחת באינקובטור CO₂ (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂).
   2. שטפו תאי DC 3x ב-PBS ו-1x ב-RMPI 10% FBS וצנטריפוגה ב-450 x גרם על מנת לשטוף את רוב החיידקים החוץ-תאיים. לבסוף, השעו מחדש תאים במדיום RMPI 10% FBS (ללא אנטיביוטיקה) ב-20 x 10⁶ תאים/מ"ל.

2. בידוד של לימפוציטים CD4⁺ T מעכברים טרנסגניים OTIIהערה: איור 1 מסכם את השלב השני הזה. יש להשתמש בבלוטות לימפה במקום בטחול כדי לבודד תאי CD4⁺ T, מכיוון ששיעור הלימפוציטים CD4⁺ בבלוטות הלימפה (~50%) גדול יותר מאשר בטחול (~25%) ולכן הטיהור יהיה יעיל יותר.

1. בצע השעיה חד-תאית של בלוטות הלימפה
   1. הסר בלוטות לימפה מפשעתיות, בית שחי, ברכיאליות, צוואר הרחם ומזנטריות מעכברים טרנסגניים OTII והעביר אותם לכלי פלסטיק עם 10 מ"ל של RPMI 10% מדיום FBS.
   2. טוחנים בלוטות לימפה מתחת למכסה מנוע סטרילי באמצעות שתי שקופיות מיקרוסקופ חלביות. הניחו את בלוטות הלימפה על צד חלבי של שקופית מיקרוסקופ אחת, ושפשפו עם הצד החלבי של השקופית השנייה עד שהאיברים נטחנו.
   3. שטפו את המתלה של תא יחיד במאגר PBS/BSA/EDTA.
   4. סנן את התאים דרך מסננת תאים (70 מיקרומטר) כדי להסיר רקמת חיבור ולשטוף עם מאגר PBS/BSA/EDTA.
   5. השעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מאגר ליזה ACK ודגרו למשך דקה אחת ב-RT על מנת לחסל כדוריות דם אדומות.
2. בידוד של תאי CD4⁺ T
   1. שטפו שוב כמו בשלב 2.1.3 וספרו תאים כדי להשעות אותם מחדש ב-100 x 10⁶ תאים /מ"ל במאגר PBS/BSA/EDTA. הוסף נוגדנים ביוטיניליים כנגד CD8, IgM, B220, CD19, MHC class II (I-Ab), CD11b, CD11c ו-DX5 ב-1:250 למשך 30 דקות על קרח לבחירה שלילית מאוחרת יותר של תאי CD4⁺ T.
   2. שטפו תאים במאגר PBS/BSA/EDTA ודגרו על התאים (100 x 10⁶ תאים/מ"ל) עם מיקרו-חרוזי סטרפטווידין בריכוז המומלץ בפרוטוקול היצרן למשך 15 דקות על קרח.
   3. שטפו תאים במאגר PBS/BSA/EDTA וסננו אותם דרך מסננת תאים (30 מיקרומטר) לפני בידוד תאי CD4⁺ T.
   4. בידוד תאי CD4⁺ T על ידי בחירה שלילית באמצעות מכונת הפרדת תאים מגנטיים לפי פרוטוקול היצרן.
   5. ספרו את התאים והתאימו ל-4 x 10⁶ תאים/מ"ל עם RPMI 10% מדיום FBS (ללא אנטיביוטיקה).
   6. תקן ושמור על קרח תאי CD4⁺ T מבודדים (3 x 10⁵ תאים) כדי לבדוק את הטוהר על ידי ציטומטר זרימה. דוגמה לטיהור תאי CD4⁺ T מוצגת באיור 3C.

3. מדידת זיהום תאי T על ידי בדיקת הגנה על גנטמיציןהערה: איור 2 מסכם את השלב השלישי הזה של הפרוטוקול.

1. זיהום טרנס-תאי T

1. דגירה של תאי CD4⁺ T מבודדים עם תאי DC נגועים (1:1) (ה-DCs נדבקו במשך שעה ונשטפו כדי לחסל חיידקים חופשיים) למשך 30 דקות כדי לאפשר היווצרות סינפסה חיסונית בחממת CO₂ (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂).

2. הוסף 0.5 מ"ל של תאי CD4⁺ T מבודדים (2 x 10⁶ תאים) ו-0.1 מ"ל של DCs נגועים (2 x 10⁶ תאים) על צלחת תרבית של 24 בארות. כביקורת שלילית, יש להדביק ישירות 0.5 מ"ל של תאי CD4⁺ T ב-MOI של 10 חיידקים למשך 30 דקות.

3. כלול בקרות נוספות המפרידות DCs נגועים מתאי T באמצעות מחסום טרנסוול פוליקרבונט (עם גודל נקבוביות של 3 מיקרומטר), המעכב מגע פיזי DC-T. הוסף 0.1 מ"ל DCs בתוך הטרנסוול ו-0.5 מ"ל תאי CD4⁺ T לתא התחתון של הבאר (צלחת 24 בארות).

4. לבסוף, השלימו עם מדיום RMPI עד שיש 0.6 מ"ל בכל באר כדי ליצור נפחים שווים בכל הדגימות.

5. לאחר 30 דקות של היווצרות סינפסה חיסונית, יש להוסיף 100 מיקרוגרם/מ"ל של גנטמיצין ולדגור למשך שעה אחת לפני איסוף תאים בחממת CO₂ (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂).

תוצאות

איור 1. תרשים זרימה של יצירת DC ובידוד תאי CD4⁺ T. בצד שמאל של האיור, מפורט התהליך להתמיינות תאים דנדריטיים (DCs) מתאי מח עצם. לאחר ניתוח עצם הירך והשוקה, תאי מח עצם מופקים מהחלק הפנימי של העצמות. לאחר מכן, תאי דם אדומים (RBC) עוב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
RPMI	פישר סיינטיפיק	SH3025501
r-GMCSF	פפרוטק	315-03
LPS	סיגמא	L2630-10 מ"ג
Na Pyruvate	תרמו סיינטיפיק	SH3023901
2-אני	ג'יבקו	31350-010
OVAp OTII (323-339)	GenScript	---
מסננת תאים 70uM	ב.ד.	352350
מזרק 30uM Filcons סטרילי	ב.ד.	340598
אוטומק קלאסי	מילטני ביוטק	130-088-887
גנטמיצין	נורמון	624601.6
טרנסוול	כוכב	3415
ליברות	פרונדיסה	1231
אגר	פרונדיסה	1800
פרפורמלדהיד 16%	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	15710
טריטון X-100
CD8 ביוט	BD Biosciences	553029
IgM ביוט	אימונוסטפ	שיבוט RMM-1
B220 ביוט	BD Biosciences	553086
CD19 ביוט	BD Biosciences	553784
MHC-II ביוט (I-A/I-E)	BD Biosciences	553622
CD11b biot	אימונוסטפ	11BB-01 מ"ג
CD11c biot	אימונוסטפ	11CB3-01 מ"ג
DX5 ביוט	BD Biosciences	553856
Gr-1 ביוט	BD Biosciences	553125
CD16/CD32	אימונוסטפ	M16PU-05MG
אנטי סלמונלה	ABD סרוטק	8209-4006
CD11cPE	BD Biosciences	553802
CD4-נגמ"ש	טונבו ביוסיינסס	20-0041-U100
נגמ"ש Gr-1	BD Biosciences	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD Biosciences	553623
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) נוגדן, נספג מאוד	Invitrogen	א-21245
CMAC (7-אמינו-4-כלורומתילקומרין)	טכנולוגיות חיים	C2110
BSA	סיגמא	A7030-100G
מיקרו-חרוזי סטרפטווידין	מילטני ביוטק	130-048-101
BD FACSקאנטו II	BD Biosciences	---