בדיקת פוטוטקסיס של ציאנובקטריה חוטית באמצעות תאורת אור ממוקדת

תקציר

מקור: Weber, N. et al., טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור בהקפאה של הלקונה החוטית Cyanobacterium Phormidium. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים מבחן מבוסס LED ממוקד לחקר פוטוטקסיס בציאנובקטריה חוטית. החיידקים נודדים לעבר מקור האור, ויוצרים הצטברות צפופה במרכז המואר, אשר מומחשת ומכומתת באמצעות ניתוח עוצמת פיקסלים של התמונה שצולמה.

פרוטוקול

1. בדיקה לפוטוטקסיס
   1. עבור ניסויי פוטוטקסיס, הכינו מחזיקי דיודות פולטות אור (LED) (כאן, עם מדפסת תלת-ממד) שבהם מותקנות נורות ה-LED 5 מ"מ שנבחרו כדי להקרין שטח של 20 מ"מ^מלמטה למעלה (איור 1). במידת הצורך, השתמש במחזיקי LED רבים במקביל, וחבר כל LED חשמלית דרך נגד ופוטנציומטר לאספקת חשמל מתכווננת. מדוד והתאם את עוצמות ה-LED, בהתאם לניסוי. ודא שכל ההגדרה נמצאת בחדר חשוך או במיכל סגור וחשוך.
   2. מניחים 8 מ"ל מהמדיום המכיל Phormidium lacuna לתוך צלחת פטרי בגודל 6 ס"מ. כוונן את עוצמת האור של הנורית. סגור את צלחת הפטרי עם המכסה והנח אותה על מחזיק LED כך שהנורית תהיה במרכז צלחת הפטרי.
   3. לאחר משך הזמן הרצוי (בדרך כלל יומיים), צלם תמונה של צלחת פטרי עם מצלמת סמארטפון המכוונת ישירות למיקום הטיפול באור. השתמש בלוח LED לבן להקרנה של הדגימה. השתמש בהגדרות הידניות של המצלמה; הימנע מהשתקפויות אור; התאם תמיד כדי לקבל את אותו מרחק בין עדשת המצלמה לדגימה. ודא שהגדרות החשיפה נותנות תמונה המתאימה לניתוחים מאוחרים יותר באמצעות ImageJ.
   4. כמת את קוטר המעגל המרכזי של החוטים באמצעות תוכנת ImageJ.
      1. פתח את ImageJ, לחץ על קובץ | פתח, בחר את הקובץ הרצוי ולחץ על Enter.
      2. בחר בלחצן ישר (עם קו ישר). לחץ על לחצן העכבר השמאלי כדי לצייר קו מקצה אחד של צלחת הפטרי לקצה הנגדי. ודא שהקו עובר דרך מרכז מעגל החוטים.
      3. לחץ על Ctrl-K במקלדת או לחץ על נתח | Plot Profile בתפריט ImageJ. חפש חלון x-y עם עוצמות פיקסלים משורטטות לעומת מרחק - פרופיל חד-ממדי של צלחת הפטרי. ודא שעוצמת הפיקסלים הנמוכה ביותר היא מעט מעל 0 והערך הגבוה ביותר הוא מתחת ל- 255.
      4. העריכו ערך ממוצע לעוצמת הפיקסלים מחוץ למעגל וערך ממוצע נוסף לעוצמת הפיקסלים במעגל. במיקום y בין ערכים אלה, הערך את ערכי ה- x של שני צידי המעגל על-ידי הצבעה עם העכבר על מיקומים אלה. שים לב לשני הערכים וחשב את ההפרש.
      5. השג את ערך ה-x הגבוה ביותר על-ידי הפניית העכבר לציר ה-y מימין. שימו לב שערך זה e מייצג את הקוטר של צלחת הפטרי. אם קוטר זה הוא 5 ס"מ, חשב את קוטר מעגל החוטים המרכזי כ-d/e ×-5 ס"מ.

תוצאות

איור 1: ניסוי פוטוטקסיס. משמאל: מחזיק LED עם 4 נוריות LED אדומות, מחובר לספק כוח מתכוונן. על גבי כל לד יש צלחת פטרי בגודל 6 ס"מ עם 8 מ"ל של תרבית לקונה פורממידיום. מימין: צלחת פטרי עם P. lacuna לאחר יומיים על הנורית האדומה (15 מיקרומול ^m-2

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות פטרי פוליסטירול, 60 מ"מ על 15 מ"מ	מרק	P5481-500EA
פוטומטר Nanodrop ND-1000	Peqlab Biotechnologie
פוטומטר אוביקון XS	Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
פיפטמן 10-100 מיקרוליטר	גילסון	מק"ט: FA10004M
תוכנה, כתובת URL
תמונהJ		תוכנה לעיבוד אימג' (עוצמות פיקסלים, קוטר מעגל)
מדיה תרבותית
f/2 -מדיום נוזלי	מי ים מלאכותיים, 0.1% (V/V) תמיסת יסודות קורט, 0.05% (V/V) תמיסת ויטמינים, 0.88 מ"מ נתרן חנקתי, 36 מיקרומטר מונוסודיום פוספט