הערכת התקשרות פנאומוקוקית לתאי אנדותל אנושיים ראשוניים תחת זרימת מדיה קבועה

תקציר

מקור: Jagau, H. et al. זיהום פנאומוקוק של תאי אנדותל אנושיים ראשוניים בזרימה מתמדת. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את ההדמיה בזמן אמת של התקשרות פנאומוקוקית למיתרי Von Willebrand Factor (VWF) על תאי אנדותל בתנאי זרימת מדיה קבועים. הוא מתאר את השלבים לגירוי שחרור VWF, תיוג המיתרים וכימות קשירת חיידקים.

פרוטוקול

1. אינדוקציה של פקטור פון ווילברנד (VWF) - שחרור והדמיה של מיתרי VWF מרובים

1. שמור על הגדרת הזרימה מכיוון שנדרש מתח גזירה של 10 דין/ס"מ² כדי להפעיל את המולטימריזציה של VWF למיתרים ארוכים של עד 200 MDa. לגרום לשחרור VWF מ-WPB אנדותל על ידי הזרקת 136 מיקרוליטר של תמיסת מלאי היסטמין של 100 מ"מ למדיום גידול תאי האנדותל עם תערובת תוספים (ECGMS) - מדיום במחזור בצינורות הזלוף באמצעות פתח הזרקה. הריכוז הסופי של היסטמין במדיום הזרימה יהיה 1 מ"מ. אם אין יציאת הזרקה זמינה, ניתן להוסיף את ההיסטמין לחלופין על ידי פיפטינג לתווך של מאגרי המשאבה.
2. לזיהוי אימונופלואורסצנטי של מיתרי VWF מרובים, עצור את הזרימה כאשר מגיעים לרמת מדיום מאוזנת במאגרים והזריק 20 מיקרוגרם של נוגדן מצומד פלואורסצאין איזותיוציאנט ספציפי ל-VWF (FITC) בנפח של 200 מיקרוליטר מלח חוצץ פוספט (PBS) (pH 7.4) לתוך 13.6 מ"ל במחזור של מדיום ECGMS באמצעות פתח הזרקה. אם אין יציאת הזרקה זמינה, ניתן להוסיף את הנוגדן לחלופין על ידי פיפטינג לתווך של מאגרי המשאבה. התוצאה היא ריכוז נוגדנים סופי של 1.3 מיקרוגרם/מ"ל.
3. לסריקה מיקרוסקופית של מספר שדות ראייה בזמן קצר, השתמש ביחידת הקרינה של המיקרוסקופ עם מכשיר פלואורסצנטי קסנון בהספק של 30% ומצלמת אפיפלואורסצנטית. עקוב אחר הצורה והמורפולוגיה של שכבת תאי האנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVEC) עם מצב השדה הבהיר כדי לבחור תאים מייצגים המתאימים להדמיית מיתרי VWF.
4. להדמיה של מיתרי VWF פלואורסצנטיים ירוקים, בחר מטרת שמן 63x/1.40 ומסנן זיהוי של 470 ננומטר בתפריט יחידת הקרינה של תוכנת המיקרוסקופ (LasX). צור תמונות של ערימות Z של לפחות 50 תצוגות שדה מייצגות, שכל אחת מהן מכילה כ-10 HUVEC שלמים מבחינה מורפולוגית. לכימות של מיתרי ה-VWF הפלואורסצנטיים הירוקים בנקודות זמן שונות, סרוק מספר שדות ראייה.

2. הערכה מיקרוסקופית של חיבור חיידקים למיתרי VWF בזרימה בזמן אמת

1. לכמת את ההתקשרות הפנאומוקוקית למיתרי ה-VWF הנוצרים על משטחי תאי HUVEC באמצעות זיהוי אימונופלואורסצנטי.
   1. החזק את הזרימה והזריק פנאומוקוק 1.35 x 10⁸ CFU/mL חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) המבטא פנאומוקוק בנפח מקסימלי של 1 מ"ל למדיום ה-ECGMS באמצעות יציאת ההזרקה. לחלופין, פיפטה את החיידקים לתוך המדיום במאגר המשאבה. הפעל מחדש את מתח הגזירה ב-10 דין/ס"מ² כדי לאפשר לחיידקים להסתובב בתוך מערכת המשאבה.
   2. בחר יעד טבילה בשמן פי 63 להגדלת מיקרוסקופ והתאם את הגדרות מסנן הקרינה בתוכנת המיקרוסקופ לערוץ RFP (מסנן זיהוי 540 ננומטר) לזיהוי פנאומוקוק המבטא RFP.
   3. לכימות החיבור של חיידקים למחרוזות VWF, עצור את הזרימה וצור תמונות של ערימות Z של לפחות 30 תצוגות שדה מייצגות, כל אחת מכילה כ-10 HUVEC שלמים מבחינה מורפולוגית, וספרו את מספר הפנאומוקוקים.
   4. השתמש באלגוריתם הסטטיסטיקה החד-גורמי של ANOVA על מנת להעריך את הנתונים, ואחריו מבחן מדגם דו-זנבי לא מזווג פוסט-הוק להשוואה סטטיסטית מפורטת. ערכי P של <0.05 נחשבו מובהקים סטטיסטית.

חומרים