הדמיה פלואורסצנטית של זיהום חיידקי הקשור לביו-חומר בעוברי דג זברה

תקציר

מקור: Zhang, X., et al. מודל עובר דג זברה להדמיה in vivo וניתוח תוך-חיוני של זיהום סטפילוקוקוס זהוב הקשור לביו-חומר. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים הדמיה פלואורסצנטית של עוברי דג זברה שהוזרקו עם Staphylococcus aureus, המאפשר כימות של התקדמות הזיהום והתפלגות החיידקים כדי להעריך את ההשפעה של מיקרוספירות ביו-חומר על אינטראקציות מארח-פתוגן in vivo.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של התקדמות זיהום וחדירת תאים מעוררת בעוברי דג זברה

1. יש להרדים את העוברים על ידי הנחתם בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה 0.02% (w/v) חומצה 3-אמינובנזואית (טריקאין) כדי להרדים אותם. לאחר 5 דקות, העבירו את העוברים לצלחת האגרוז המכוסה במדיום E3 המכיל 0.02% (w/v) טריקאין ויישרו אותם בכיוון אחד להזרקה. פיפטה 500 מיקרוליטר של PBS (תמיסת מלח חוצצת פוספט)-2% (wt) מתיל צלולוז לתוך צלחת פטרי המכילה מדיום E3 עם 0.02% (w/v) טריקאין. מניחים את העוברים בתמיסת המתיל צלולוז ושומרים אותם ישרים ואופקיים.
   הערה: תמיסת מתיל צלולוז משמשת כ"דבק ", אשר בשל צמיגותו יכול לשתק באופן זמני עוברים בכיוון הטוב ביותר להדמיה.
2. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו המצויד במסנני שדה בהיר, mCherry, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו-UV (אולטרה סגול) כדי לדמות עוברים בודדים תחת הגדרות אופטימליות זהות (למשל, עוצמה, רווח וזמן חשיפה) בהגדלה של פי 160. הגדר את מישור המוקד כך שהנזק לרקמות שנגרם מההזרקה יהיה ממוקד, באמצעות מסנן השדה הבהיר. הגדר את עומק מחסנית ה-Z ל-10 מיקרומטר ואת גודל הצעד ל-5 מיקרומטר, מה שמאפשר הקלטה של 3 תמונות רצופות.
3. דמיין עוברים בודדים פעם ביום מ-5 שעות לאחר ההזרקה ועד יומיים לאחר ההזרקה. לא לכלול עוברים מתים (ללא פעימות לב או עובר מושפל חלקית) לצורך הדמיה וניתוח נוספים. שמור על עוברים בנפרד במדיום E3 בצלחות של 48 בארות. רענן את המדיום מדי יום.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרוספירות פוליסטירן בקוטר 10 מיקרומטר (פלואורסצנט כחול)	טכנולוגיית חיים/ThemoFisher	F8829
3-חומצה אמינו-בנזואית (טריקאין)	סיגמא-אולדריץ'	E10521-50G
מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו LM80	לייקה	MDG3610450126
מתיל תאית 4000cp	סיגמא-אולדריץ'	MO512-250G
פטרי-צלחת	בז	353003
פטרי-צלחת	ביומריו	NL-132
תמונהJ	לא ישים	לא ישים	קישור: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0	פריזמה	לא ישים