ניתוח in vivo של זיהומים חיידקיים הקשורים להשתלה באמצעות עוברי דג זברה

תקציר

מקור: Zhang, X. et al., מודל עובר של דג זברה להדמיה In Vivo וניתוח תוך-חיוני של זיהום סטפילוקוקוס זהוב הקשור לביו-חומר. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים מודל עוברי של דג זברה לחקר זיהומים הקשורים לביו-חומרים מושתלים. הזרקת סטפילוקוקוס זהוב עם מיקרוספירות פוליסטירן משפרת את הישרדות החיידקים, ומאשרת את תפקידם של חומרים מושתלים בקידום זיהום.

פרוטוקול

1. הכנת תרחיפי חיידקים בלבד וחיידקים-מיקרוספירות

הערה: נעשה שימוש בזן Staphylococcus aureus RN4220 המבטא חלבון פלואורסצנטי mCherry (S. aureus-mCherry). הזן S. aureus RN4220 עבר מוטציה בגן מווסת האלימות agrA (מווסת גן אביזר A), ולכן עשוי להיות בעל אלימות נמוכה יחסית במודל העובר של דג הזברה. ניתן להשתמש בזנים אחרים של S. aureus או במיני חיידקים אחרים לזיהום הקשור לביו-חומר (BAI).

1. קח 4 עד 5 מושבות של חיידקי S. aureus RN4220 מצלחות תרבית אגר סויה טריפטית בתוספת 10 מיקרוגרם/מ"ל כלורמפניקול ותרבית את החיידקים לשלב גידול לוגריתמי ב-10 מ"ל של מרק סויה טריפטי בתוספת 10 מיקרוגרם/מ"ל כלורמפניקול ב-37 מעלות צלזיוס תחת ניעור.
   1. במהלך התרבית, יש לדלל 100 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים ב-900 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים עם חוצץ פוספט (PBS) בקובטה (רוחב של 1 ס"מ) למדידת צפיפות אופטית (OD) ב-620 ננומטר (OD₆₂₀). תרבית החיידקים עד שה- OD₆₂₀ מגיע ל 0.4-0.8.
      הערה: OD₆₂₀ של 0.1 מתאים בדרך כלל ל-3.0 x 10⁷ יחידות יוצרות מושבה (CFU)/mL S. aureus. ה-OD₆₂₀ של חיסון של חיידקים בשלב הגידול הלוגריתמי הוא בין 0.4-0.8. ייתכן שיהיה צורך בפרקי זמן שונים לתרבית עבור מינים וזנים אחרים של חיידקים.
2. חיידקי צנטריפוגה ב-3,500 x גרם למשך 10 דקות ומשעים מחדש את החיידקים הגלולים ב-1 מ"ל של PBS סטרילי. לאחר מכן, שטפו את החיידקים עם PBS סטרילי פעמיים, ולבסוף השעו מחדש את החיידקים ב-1.1 מ"ל של תמיסת 4% (w/v) polyvinylpyrrolidone40 (PVP40) ב-PBS.
3. מערבולת תרחיף חיידקי זה ומדלל 100 מיקרוליטר מהתרחיף ב-900 מיקרוליטר של PBS סטרילי בקובט למדידת OD₆₂₀ . התאם את ריכוז התרחיף החיידקי עם תמיסת PVP40. זהו ההשעיה "לחיידקים בלבד".
4. ניתן לבחור באופן חופשי ביו-חומרים לערבב עם תרחיף החיידקים. במחקר הנוכחי משתמשים במיקרוספירות פוליסטירן מסחריות (PS) (פלואורסצנט כחול, 10 מיקרומטר). כדי ליצור תרחיף חיידקים-מיקרוספרות, צנטריפוגה של המיקרוספירות למשך דקה אחת ב-1,000 x גרם, טמפרטורת החדר, השליכו את הסופרנטנט ותלו מחדש את המיקרוספירות בתרחיף "חיידקים בלבד" (בתמיסת PVP40).
5. על מנת להזריק מינונים שווים בערך של חיידקים בנוכחות ובהיעדר מיקרוספרות, ריכוז תרחיף החיידקים-מיקרוספירות צריך להיות שני שלישים מריכוז התרחיף "חיידקים בלבד" (ללא מיקרוספרות). זה מושג על ידי דילול תרחיף החיידקים-מיקרוספירות בנפח 0.5 של תמיסת PVP40. מערבבים את המתלים על ידי מערבולת. יש לציין כי יחס זה (שני שלישים) הוערך עבור S. aureus. הוא מתאים גם ל-S. epidermidis, אך מומלץ לבדוק אם יחס זה חל גם על מיני חיידקים אחרים וגדלים אחרים (מעל 10 מיקרומטר) או צורות של ביו-חומרים (מאשר מיקרוספרות) שיש להזריק.
6. בדוק את ריכוז התרחיף "חיידקים בלבד" וחיידקים-מיקרוספירות על ידי תרבית כמותית של דילולים סדרתיים פי 10 כדלקמן: העבר 100 מיקרוליטר מהמתלים לצלחת באר 96 ודלל באופן סדרתי על ידי העברת 10 מיקרוליטר של המתלה ל-90 מיקרוליטר של PBS סטרילי. צלחת משכפלת 10 מיקרוליטר של המתלים הלא מדוללים והמדוללים על לוחות אגרוז, דוגרים את הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, סופרים את המושבות ומחשבים את מספר החיידקים (יחידות יוצרות מושבה, CFU).

2. רבייה, קציר ותחזוקה של עוברי דג הזברה

1. עקוב אחר הנהלים הכלליים לגידול, קציר ותחזוקה של עוברי דג הזברה, עם שינויים המתוארים להלן. חצו משפחה של דג זברה או דג זברה מסוג בר מסוג Tupfel Long Fin (TL) או דג זברה מהקו הטרנסגני שנבחר (כאן, Mpeg1: Kaede) במיכל עם רשת נוספת כדי לגרום לנקבות הבוגרות לייצר ביצים לאחר שהאור נדלק, ואז הפרד את הבוגרים מהביצים המיוצרות.
2. למחרת, אספו את העוברים והשליכו את העוברים הלא שקופים, שאינם ברי קיימא. שמור כ-60 עוברים לכל צלחת פטרי (קוטר 100 מ"מ) במדיום E3 ודגר בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. הסר עוברים מתים וחריגים ורענן את מדיום E3 מדי יום.

3. הכנת מחטי הזרקה

1. הכן את מחטי המיקרו-נימי הזכוכית להזרקה באמצעות מכשיר מושך מיקרופיפטה. השתמש בהגדרות הבאות: חום: 772, משיכה: 100, וול: 200, זמן: 40, גז: 75.
2. שוברים את קצה המחט בעזרת מלקחיים במיקום שבו למחט יש קוטר חיצוני של כ-20 מיקרומטר (עבור מיקרוספירות של 10 מיקרומטר), באמצעות מיקרוסקופ אור עם סרגל קנה מידה בעיניים. הימנע ממחטים בגודל פתח גדול מאוד, מכיוון שהן יפגעו בהישרדות העוברים.
   הערה: הפתח עשוי להיבחר להיות קטן יותר או גדול יותר, כתלות בגודל ובצורת הביו-חומרים שיש להזריק. בספרות דווח כי הזרקות באמצעות מחטים עם פתח של כ-50 מיקרומטר גורמות לירידה משמעותית בהישרדות העוברים.

4. הזרקת תרחיף חיידקים בלבד או מיקרוספירות חיידקים לעוברי דג הזברה

1. מחממים תמיסת אגרוז (1-1.5% (משקל) בחצי מים) באמצעות מיקרוגל ויוצקים לתבנית פטרי בקוטר 100 מ"מ. הניחו תבנית תבנית פלסטיק על גבי תמיסת האגרוז בצלחת הפטרי כדי ליצור חריצים באגרוז להצבת עוברים במיקומים נכונים ולהקל על הזרקות. דוגרים בטמפרטורת החדר ומסירים את התבנית כאשר תמיסת האגרוז התמצקה.
2. לאחר ההפריה התלת-ממדית, הניחו את העוברים בצלחת פטרי בגודל 100 מ"מ המכילה 0.02% (w/v) חומצה 3-אמינובנזואית (טריקאין) כדי להרדים אותם. לאחר 5 דקות, העבירו את העוברים לצלחת האגרוז המכוסה במדיום E3 המכיל 0.02% (w/v) טריקאין ויישרו אותם בכיוון אחד להזרקה. עבור Mpeg1: קו טרנסגני של Kaede מרדים לראשונה עוברים במדיום E3 המכיל 0.02% (w/v) טריקאין. לאחר מכן, בחר עוברים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו.
3. טען את המחט בכ-10 מיקרוליטר של מתלה "חיידקים בלבד" או חיידקים-מיקרוספירות באמצעות קצה פיפטה של מיקרו-מעמיס. התקן את המחט על מיקרומניפולטור המחובר למיקרו-מזרק. עבור המזרק המשמש כאן (ראה טבלת חומרים), השתמש בהגדרות הבאות להזרקות של 2-3 nL: לחץ: 300-350, לחץ גב: 0, זמן: 2 אלפיות השנייה. הערה: ההגדרות של המיקרו-מזרק תלויות במזרק בו נעשה שימוש. ייתכן שיהיה צורך להתאים את הגדרות המזרק להזרקות של חיידקים מעורבבים עם ביו-חומרים עם צורות או גדלים אחרים.
   1. השתמש במחטים עם אותו פתח להזרקת התרחיף "חיידקים בלבד" ותרחיף חיידקים-מיקרוספרות. אם המחט שבורה או סתומה, החלף תמיד למחט חדשה להזרקות נוספות.
4. הכניסו את המחט לרקמת השריר של העוברים תחת מיקרוסקופ אור (איור 1), בזווית של 45-60 מעלות בין המחט לגוף העוברים. התאם את מיקום המחט ברקמה על ידי הזזתה בעדינות קדימה ואחורה. הזרקו את העוברים באמצעות דוושת רגל המחוברת למיקרו-מזרק.
5. לאחר הזרקת חיידקים פלואורסצנטיים, ציינו את העוברים לזיהום מוצלח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו. השליכו את העוברים שקיבלו ציון שלילי (ללא חיידקים פלואורסצנטיים גלויים או ללא מיקרוספירות פלואורסצנטיות גלויות). שמור על עוברים בנפרד במדיום E3 בצלחות של 48 בארות. רענן את המדיום מדי יום.

5. ריסוק עוברים, ניקוד מיקרוסקופי ותרבית כמותית של חיידקים

1. מדרגים את כל העוברים במיקרוסקופ לנוכחות חיידקים פלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו, החל מיד לאחר ההזרקות ובכל יום לאחר מכן עד שהעוברים נבחרים באופן אקראי לתרבית כמותית.
2. בחר באופן אקראי כמה עוברים נגועים חיים (5 עד 6 במחקר הנוכחי) זמן קצר לאחר ההזרקה והעביר אותם בנפרד כדי להפריד 2 מ"ל מיקרו-צינורות באמצעות קצוות סטריליים. הסר את המדיום, שטוף את העוברים בעדינות עם PBS סטרילי פעם אחת והוסף 100 מיקרוליטר PBS סטרילי.
3. הוסף 2-3 חרוזי זירקוניה סטריליים (קוטר 2 מ"מ) לכל בקבוקון ומועך את העוברים באמצעות ההומוגנייזר (ראה טבלת חומרים) ב-3,500 סל"ד למשך 30 שניות. תרבית ההומוגנציה כמותית כמתואר בשלב 1.3.
   הערה: הומוגנייזרים אחרים עשויים לדרוש הגדרות שונות.
4. בחר באופן אקראי מספר עוברים בימים שלאחר ההזרקה לתרבית כמותית לפי שלב 5.3.

תוצאות

איור 1: הליך סכמטי של הזרקה משותפת של תרחיף חיידקים-מיקרוספירות לשריר הזנב של עוברי דג הזברה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגר סויה טריפטי	BD דיפקו	236950	יחידת הכנת מדיה ב-AMC
מרק סויה טריפטי	BD דיפקו	211825
פוליוויניל פירולידון40	אפליקציה	א2259.0250
מיקרוספירות פוליסטירן בקוטר 10 מיקרומטר (פלואורסצנט כחול)	טכנולוגיית חיים/ThemoFisher	F8829
מיקרו-קפילרי זכוכית (1 מ"מ OD x 0.78 מ"מ קוטר פנימי)	מנגנון הרווארד	30-0038
מכשיר מושך מיקרופיפטה	סאטר אינסטרומנט בע"מ	P-97 בוער
מיקרוסקופ אור LM 20	לייקה	MDG33 10450123
3-חומצה אמינו-בנזואית (טריקאין)	סיגמא-אולדריץ'	E10521-50G
אגרוז חבר פרלמנט	רוש	11388991001
מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו LM80	לייקה	MDG3610450126
קצות פיפטה של מיקרו-מעמיס	אפנדורף	5242956.003
מיקרומניפולטור M3301 עם מעמד M10	מכשירי דיוק עולמיים	00-42-101-0000
מיקרו-מזרק אקספרס FemtoJet	אפנדורף	ברקוד 5248ZO100329
מיקרוטרוב 2 מ"ל לאדם	סרשטדט	72.693.005
חרוזי זירקוניה	חיבור ביולוגי	ברקוד 11079124ZX
לייזר MagNA	רוש	41416401
כלורמפניקול	סיגמא-אולדריץ'	ג0378
שייקר ג'ירוטרי (לגידול חיידקים)	ניו ברונסוויק סיינטיפיק	G10
חממת דג הזברה	VWR	קו אינקו
קובטות	מותג	759015
צנטריפוגה	הטיך-צנטריפוגן	רוטנטה 460R
ספקטרומטר	רוקחות ביוטק	אולטרוספקט®2000
מלקחיים	סיגמא-אולדריץ'	F6521-1EA
48 צלחות באר	גריינר ביו-וואן	677180
96 צלחות באר	גריינר ביו-וואן	655161
פטרי-צלחת	בז	353003
פטרי-צלחת	ביומריו	NL-132