שיטה ויזואלית רגישה לאיתור חיידקים המייצרים מימן גופרתי

תקציר

מקור: Zhu, W., & Chu, W. שיטה חזותית רגישה לזיהוי חיידקים המייצרים מימן גופרתי. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים שיטה ויזואלית רגישה לזיהוי מהיר של חיידקים המייצרים מימן גופרתי. שינוי צבע מצהוב לשחור מעיד על פעילות חיידקית באמצעות היווצרות ביסמוט גופרתי.

פרוטוקול

1. זני חיידקים

הערה: לצורך ניסוי זה נעשה שימוש בתשעה זנים סטנדרטיים, כולל Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris ו-Klebsiella pneumoniae. סלמונלה paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa ו-Proteus vuigaris יכולים לייצר H₂S.

1. הכנת תרבית חיידקים
   1. להעביר מושבת חיידקים אחת של סלמונלה paratyphi A, סלמונלה paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 ו-Klebsiella pneumoniae מצלחת אגר Luria-Bertani (LB) ל-100 מ"ל של מדיום LB ולתרבית ב-37 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות עד שריכוז החיידקים הוא כ-1 x 10⁹ תאים/מ"ל (כפי שמצוין על ידי OD₆₀₀ = 1).
   2. העבירו מושבת חיידקים אחת של Fusobacterium nucleatum ו-Proteus vuigaris מצלחות אגר מרק סויה טריפטיקאז (TSB) ל-100 מ"ל של מדיום TSB ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס באופן אנאירובי למשך 24 שעות עד שריכוז החיידקים הוא בערך 1 x 10⁹ תאים/מ"ל (כפי שמצוין על ידי OD₆₀₀ = 1).

2. בדיקת זיהוי H₂S

1. מבחן ייצור מימן גופרתי
   1. מערבבים 100 מיקרוליטר של תרבית חיידקים עם 100 מיקרוליטר של תמיסת ביסמוט שהוכנה לאחרונה (pH 8.0; 10 מ"מ ביסמוט (III) כלוריד, 0.4 מ"מ טריאתנולמין-HCl, 20 מ"מ פירידוקסל 5-פוספט מונוהידרט, 20 מ"מ EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית) ו-40 מ"מ L-ציסטאין) בצלחות המיקרוטיטר של 96 בארות ובתרבית למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. עבור כל זן חיידקים, בצע את הניתוח בשלוש עותקים.
   2. לאחר 20 דקות, בדוק אם יש שינוי צבע. אם צבע התמיסה משתנה מצהוב בהיר לשחור, זה מצביע על כך שהחיידקים מסוגלים לייצר H₂S. חזור על מדידה זו פי 3.
2. רגישות השיטה
   1. קבע את רגישות השיטה באמצעות ריכוזים שונים של נתרן הידרוסולפיד (NaHS): 2 מ"מ, 1 מ"מ, 0.8 מ"מ, 0.6 מ"מ, 0.4 מ"מ, 0.2 מ"מ, 0.1 מ"מ ו-0 מ"מ, מעורבב עם תמיסת BS (ביסמוט גופרתי).
   2. קבע את נוכחותו של HS⁻/S²⁻ על ידי התבוננות בהיווצרות משקע BS שחור. ציין את צבע הבארות באמצעות סולם חזותי מחוסר הפקת צבע (-) לייצור צבע שחור כהה ביותר (++++++).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ביסמוט (III) כלוריד	שנחאי מקלין ביוכימיה ושות', בע"מ	7787-60-2
EDTA	נאנג'ינג ריאגנט כימי ושות', בע"מ	60-00-4
Fusobacterium nucleatum	ATCC	25586
ל-ציסטאין	אמרסקו	52-90-4
טריאתנולמין-הידרוכלוריד	שנחאי אלאדין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ	637-39-8
נתרן הידרוסולפיד
פיפטה