הכנת חיסון חיידקי חד-תאי

תקציר

מקור: Niu, L., et al., הדמיה של מוות תאי ליטי מקרופאגים במהלך זיהום מיקובקטריאלי בעוברי דג זברה באמצעות מיקרוסקופיה תוך-חיונית. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את הכנת תרחיף תאי יחיד Mycobacterium marinum מתרבית שלב מאוחר לשימוש עקבי במבחני זיהום ויישומים במורד הזרם.

פרוטוקול

1. Mycobacterium marinum הכנת חיסון חד-תאי (איור 1)

1. יש להפשיר מלאי גליצרול Mycobacterium marinum גליצרול פלואורסצנטי מ-80 מעלות צלזיוס ולחסן צלחת אגר 7H10 עם 10% (v/v) OADC (חומצה אולאית, אלבומין, דקסטרוז, קטלאז), 0.25% גליצרול ו-50 מיקרוגרם/מ"ל היגרומיצין. דגרו על הצלחת בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס למשך כ-10 ימים.
2. בחר מושבה המבטאת פלואורסצנטיות חיובית וחסן 3 מ"ל של מדיום 7H9 עם 10% OADC, 0.5% גליצרול ו-50 מיקרוגרם/מ"ל היגרומיצין.
   1. דגרו את החיסון בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס ו-100 סיבובים לדקה (סל"ד) למשך 4-6 ימים עד שהתרבית מגיעה לשלב הלוגריתמי (OD₆₀₀ = 0.6-1.0).
   2. תת-תרבות (1:100) ב-30 מ"ל של מדיום 7H9 טרי עם 10% OADC, 0.5% גליצרול, 0.05% Tween-80 ו-50 מיקרוגרם/מ"ל עד שה-OD₆₀₀ מגיע ל-~1.0.
      הערה: בשלב זה, מומלץ שלב תת-תרבות לאיכות התרבות הגבוהה ביותר. מניסיוננו, הוספת השיבוט ישירות לנפח גדול של מדיום תוביל להיווצרות גושי חיידקים.
3. אסוף תאי M. marinum כמתואר להלן.
   1. צנטריפוגה ב-3,000 x גרם למשך 10 דקות לאיסוף M. marinum ככדור. השליכו את כל הסופרנטנט מלבד 300 מיקרוליטר והשתמשו בו להשעיית הגלולה.
   2. הוסף 3 מ"ל של מדיום 7H9 עם 10% גליצרול כדי להשעות עוד יותר את הגלולה, ולאחר מכן סוניקציה של התרחיף באמבט מים ב-100 וואט ב-15 שניות מופעל, 15 שניות כבוי למשך 2 דקות בסך הכל.
      הערה: סוניקציה משמשת להשגת הומוגנאט של תא בודד עבור החיסון, המונע את חסימת מחט המיקרו-הזרקה.
4. העבירו את תרחיף החיידקים למזרק של 10 מ"ל והעבירו אותו דרך מסנן של 5 מיקרומטר להסרת גושים.
5. מדוד את הצפיפות האופטית (OD) של המתלה באמצעות ספקטרופוטומטר ודלל אותו ל-OD₆₀₀ = 1.0 עם מדיה 7H9 המכילה 10% גליצרול. מחלקים את המתלה ל-10 מיקרוליטר ושומרים במקפיא -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
6. אשר את ריכוז החיידקים של החיסון (cfu/mL) על ידי דילול סדרתי וציפוי של מלאי החיידקים על צלחת אגר 7H10 המכילה 10% (v/v) של OADC, 0.5% של גליצרול ו-50 מיקרוגרם/מ"ל של היגרומיצין.

תוצאות

איור 1: דיאגרמה סכמטית של הכנת חיידקים חד-תאיים. מלאי Mycobacterium marinum חד-תאי פלואורסצנטי נוצר בעקבות התהליך המתואר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.05% טווין-80	סיגמא	עמ' 1379
מזרק 10 מ"ל	סולארביו	יא0552
10% OADC	ב.ד.	211886
מסנן 5 מיקרומטר	מיל X	SLSV025LS
50 מיקרוליטר/מ"ל היגרומיצין	סנגון ביוטק	A600230
7H10	ב.ד.	262710
7ח9	ב.ד.	262310
תא סביבתי	פקון	בקרת טמפרטורה 37-2 דיגיטלית
מיקרו-מעמיס אפנדורף	אפנדורף	מספר לא 5242956003
גליצרול	סנגון ביוטק	A100854
אינקובטור	קילריין	PH-140(א)
מיקובקטריום מרינום			ATCC BAA-535
סוניקטור	SCICNTZ	JY92-IIDN
ספקטרופוטומטר (OD600)	אפנדורף AG	22331 המבורג