השגת עמילואידים ציטוטוקסיים בעקבות זיהום חיידקי של תאי אנדותל ריאתיים של חולדות

תקציר

מקור: Balczon, R., et al. שיטות לאיתור עמילואידים ציטוטוקסיים בעקבות זיהום של תאי אנדותל ריאתיים על ידי Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את ההליך ליצירת סופרנטנט ציטוטוקסי מתאי אנדותל ריאתיים לאחר זיהום ב-Pseudomonas aeruginosa. הוא מתאר כיצד חלבוני אפקטור חיידקיים משבשים את מבנה התא המארח וגורמים לשחרור של אוליגומרים עמילואידים ציטוטוקסיים לתוך הסופרנטנט.

פרוטוקול

1. יצירת סופרנטנטים ציטוטוקסיים:

תרביות ראשוניות של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים של חולדות (PMVECs) התקבלו ממתקן ליבת תרבית התאים במרכז לביולוגיה של הריאות באוניברסיטת דרום אלבמה.

1. ליצירת סופרנטנטים ציטוטוקסיים, צלחו 2 x 10⁶ תאים לצלחות בודדות של 150 ס"מ וגדילו במשך 3 - 4 ימים עד להשגת מפגש. השתמש בשתי צלחות לכל ניסוי.
2. כדי לייצר סופרנטנט, שטפו את אחד משני הכלים בקוטר 150 ס"מ של PMVECs עם מי מלח עם חוצץ פוספט, טריפסינים ואז ספרו את התאים. שטפו את המנה השנייה של PMVECs עם תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) ולאחר מכן הדביקו באחד מהזנים של Pseudomonas aeruginosa בריבוי זיהומים (MOI) של 20:1. זה מושג באופן הבא:
   1. עבור P. aeruginosa, OD₅₄₀ 0.25 = 2 x 10⁸ CFUs/mL. להכנת דילול זה, הוסף 1 מ"ל HBSS לקובטה חד פעמית של 1 מ"ל. גרד מספיק חיידקים מהצלחת עד להשגת OD₅₄₀ של 0.25 כאשר נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר. השלב הבא יספק חישוב של כמה חיידקים יידרשו.
   2. לאחר קביעת מספר ה-PMVECs בצלחת התרבית, קבע את מספר החיידקים המתאים שיש להוסיף לכלי התרבית השני, ללא טריפסין, המכיל את ה-PMVECs. לדוגמה, אם נקבע שצלחת התרבית של PMVECs מכילה 1.3 x 10⁷ תאים, אז הכינו 1.3 x 10⁷ תאים x 20 חיידקים/תא x 1 מ"ל/2 x 10⁸ CFUs = 1.3 מ"ל חיידקים.
   3. מדללים את 1.3 מ"ל החיידקים ל- HBSS לנפח סופי של 20 מ"ל, כך שניתן יהיה לכסות את כל פני השטח של צלחת בגודל 150 ס"מ בנוזל, ואז להוסיף את החיידקים המדוללים לצלחת ה- PMVECs.
   4. דגרו את ה-PMVECs המחוסנים בחיידקים ב-37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO₂ למשך 4-5 שעות, עד שניתן לראות פערים נוצרים בחד-שכבת התא כאשר הצלחת נצפית במיקרוסקופ (ראה איור 1 לרמה נכונה של היווצרות פערים).
   5. אספו את הסופרנטנט, ואז צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-2,000 x גרם בצנטריפוגה שולחנית כדי להסיר פסולת תאית.
      הערה: ניתן להשתמש בכל צנטריפוגה שולחנית המסוגלת לייצר כוח g מספיק כדי לגלול תאים לא ליזים ושברי תאים גדולים לשלב זה.
   6. שפכו את הסופרנטנט למזרק שמחובר לקצהו מסנן של 0.2 מיקרומטר, ואז העבירו את הסופרנטנט דרך המסנן כדי להסיר חיידקים.
   7. השתמש במנה של הסופרנטנט הסטרילי כדי לבדוק ציטוטוקסיות ולהקפיא את שאר הסופרנטנט ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

תוצאות

איור 1. השפעות חיסון P. aeruginosa על מורפולוגיה של PMVEC. חד-שכבתי משולבת של PMVECs לפני (A) וארבע שעות לאחר הוספה (B) של זן PA103 של P. aeruginosa. ניתן לראות בבירור פערים בשכבת התא החד-שכבתי בתאים הנגועים. סרגל קנה מידה = 100 מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
HBSS	ג'יבקו	14025-092
PBS	ג'יבקו	10010-023
מסנני מזרק 0.22 מיקרון	מיליפור	SLGP033RS
DMEM	ג'יבקו	11965-092
מונה סלולרי אוטומטי של הרוזנת	Invitrogen	C10277
רכזי מיקרו-צטריפוגה - ניתוק של 10,000 מגה-וואט	מיליפור	UFC801008
זנים PA103 ו- ΔPcrV			זנים אלה של P. aeruginosa הושגו מד"ר דארה פרנק, המכללה הרפואית של אוניברסיטת ויסקונסין, מילווקי, ויסקונסין
אגר	פישר	BP1423-500
סרום בקר עוברי	שיקלון	SH30898.03IH
PenStrep	ג'יבקו	15070063