מעקב אחר דינמיקת זיהום חיידקי בעכבר באמצעות ביולומינסנציה

תקציר

מקור: Valentine, M. E., et al. יצירת מוטציות של מחיקת גנים בתוך המסגרת ב-Pseudomonas aeruginosa ובדיקת הנחתת אלימות במודל עכבר פשוט של זיהום. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את השימוש בביולומינסנציה כדי לדמיין ולהשוות את ההתנהגות in vivo של זני חיידקים אלימים ומוחלשים בעכברים. הוא מתאר את הכנת תרחיפי החיידקים הביו-לומינסנטים והזרקתם התוך-צפקית לעכברים. הזן האלים מפגין התפשטות מערכתית, בעוד שהזן המוחלש נשאר מקומי ומתנקה בהדרגה, כפי שמצוין על ידי אות הדעיכה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. חיסון בעלי חיים עם זני חיידקים בהזרקה
   1. בבוקר ההזרקות יש להסיר קריוביאלים של זני החיידקים הנבדקים ולהפשיר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 3-4 שעות. להפשיר 0.5 מ"ל לכל עכבר שיוזרק. שמור בקבוקונים על קרח לאחר ההפשרה והזריק עכברים תוך שעתיים.
   2. לאחר ההפשרה, העבירו כל קריוביאל לצינור חדש של 2 מ"ל וצנטריפוגה ב-4,500 x גרם למשך 10 דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של 1x PBS (מי מלח חוצצים פוספט).
   3. שוב צנטריפוגה ב -4,500 x גרם למשך 10 דקות. יש להשליך את הכדור ולהשעות אותו מחדש ב-1x PBS לריכוז סופי של 2.5 x 10⁹ CFU/mL (CFU: יחידות יוצרות מושבה). הכמות המדויקת של 1x PBS בשימוש תשתנה מעט בין הזנים.
      1. קח 3 דגימות מההשעיה הסופית של כל זן כדי לאמת CFU/mL, גנוטיפ ופנוטיפ כמתואר לעיל.
   4. עבור כל זן, יש להקצות 1.5 מ"ל של PBS/תרחיף תאים לתוך צינור אחד של 2 מ"ל לכל 5 עכברים כדי להגביל את מספר הפעמים שהצינורית נכנסת. כמו כן, הכינו צינורות של 1x PBS להזרקות בקרה.
   5. אסוף עכברים (10 זכרים ו-10 נקבות C57BL/6 לקבוצה לניסוי זה) וחומרים הדרושים להזרקות (מזרקים, מחטים, מיכלים חדים, טושים, עט ונייר וכו'). עברו לחדר הניתוחים הסטרילי של בעלי חיים. נגב את כל המשטחים במגבוני חיטוי.
      1. כדי למנוע מצוקה וסיכון לפגיעה בנסיין, הביאו רק מין אחד וקבוצת ניסוי אחת של עכברים לחדר הניתוח בכל פעם (למשל, קבוצה של 10 עכברים זכרים שנדבקו בזן מסוים). ללבוש שני זוגות כפפות לטקס כדי למנוע ניקוב של כפפות אם ננשך. ללבוש חלוק מעבדה, משקפי בטיחות ומסכת פנים כדי למנוע זיהום.
   6. התחל בזריקות של קבוצת הביקורת עם 1x PBS. זה יבדוק אם תופעות לוואי כלשהן נובעות מהזריקה בלבד.
      1. הוצא עכבר מהכלוב. הסר רק עכבר אחד בכל פעם.
      2. שקלו את העכבר וסמנו את זנבו בטוש קבוע כדי לעקוב אחר ירידה במשקל לאחר ההזרקה.
      3. פתח מזרק חדש של 1 מ"ל ומחט 27 גרם (השתמש במזרק ומחט חדשים לכל עכבר כדי למנוע זיהום) והזריק 200 מיקרוליטר של PBS סטרילי 1x.
         1. תפוס את העכבר מאחורי אוזניו באמצעות האגודל והאצבע. צבטו כדי ליצור קפל עור בעורף כדי להיאחז בו - קפל הדוק יותר מפחית את תנועת הצוואר ואת הסיכון לנשיכה במהלך ההזרקה. אבטח את הזנב בכף היד באמצעות הזרת כדי להחזיק את העכבר שטוח בתנועה מועטה.
         2. הפוך את העכבר והכנס מחט בזווית של 30 מעלות לחלל הצפק בצד שמאל או ימין של קו האמצע. הרם מעט את המחט לאחר החדרתה כדי לוודא שהיא הוחדרה לאזור התוך-צפקי ולא לאיברים. הזריק לאט את ה-PBS ולאחר מכן משוך את המחט.
         3. הנח את המחט המשומשת במיכל חד ייעודי לסיכון ביולוגי. אין לעשות שימוש חוזר במזרק או במחט. בולוס במקום ההזרקה הוא אופייני.
      4. לאחר ההזרקה, העבירו את העכבר לכלוב נפרד.
      5. חזור על ההליך עם העכבר הבא. לאחר הזרקת כל העכברים בכלוב אחד, החזירו אותם מיד לכלוב המקורי שלהם.
   7. לאחר הזרקת קבוצת הביקורת, התחל להזריק תרחיפים של זנים שייבדקו לפי אותו הליך.
      1. הזרקו 200 מיקרוליטר מתרחיף התאים. כאשר מתחילים עם תרחיפי תאים של 2.5 x 10⁹ CFU/mL, כל עכבר מקבל 5 x 10⁸ CFU.
         הערה: ריכוזים אלה עברו אופטימיזציה עם מחקר ראשוני בבעלי חיים כדי לקבוע מינונים קטלניים של כל זן. ייתכן שיהיה צורך להתאים את המינון לזנים/מינים אחרים.
   8. לאחר השלמת כל הזריקות, החזירו את העכברים לחדר המגורים כדי להקל על המצוקה. אזור עבודה נקי עם מגבוני חיטוי.
   9. עקבו אחר תמותה של בעלי החיים לאחר ההזרקה על ידי בדיקת כלובים לאיתור עכברים מתים כל 3 שעות במשך 72 שעות וכל 12 שעות במשך 10 ימים. רשום את משקל העכברים כל 12 שעות כדי לקבוע ירידה במשקל עקב מחלה.

חומרים