יצירת רקומביננטים מוצלבים כפולים של Pseudomonas aeruginosa למחיקת גנים ממוקדת

תקציר

מקור: Valentine, M. E., et al. יצירת מוטציות של מחיקת גנים בתוך המסגרת ב-Pseudomonas aeruginosa ובדיקת הנחתת אלימות במודל עכבר פשוט של זיהום. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים את הדור של רקומביננטים מוצלבים כפולים ב-Pseudomonas aeruginosa באמצעות אסטרטגיית מחיקת גנים מבוססת פלסמיד. התהליך כולל בחירת חיידקים המכילים פלסמיד שאינו משכפל המשולב בגנום באמצעות הצלבה בודדת ולאחר מכן גרימת אירוע רקומבינציה שני תחת בחירת סוכרוז כדי לכרות את הפלסמיד. רקומבינציה מוצלחת של הצלבה כפולה מאושרת על ידי אובדן העמידות לאנטיביוטיקה והיכולת לגדול על מצע המכיל סוכרוז.

פרוטוקול

1. איתור רקומביננטים מוצלבים כפולים של P. aeruginosa

1. עבור כל תרבית ציר, יש לחסן 10 מיקרוליטר של תרבית על צלחת מחוממת מראש של PIA (Pseudomonas Isolation Agar) בתוספת 10% סוכרוז (ללא גליצרול) ופס למושבות מבודדות. דגרו צלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
2. למחרת, הוציאו צלחות מהחממה ובדקו אם הן צומחות. מושבות עמידות לסוכרוז צריכות להיות רקומביננטים מוצלבים כפולים (כלומר, הסירו את הפלסמיד מהכרומוזום באמצעות אירוע רקומבינציה בין האזור ההומולוגי האחר של הכנסת הפלסמיד לכרומוזום P. aeruginosa ).
   1. הדביקו לפחות 20 מושבות עם קיסמים סטריליים על צלחות שחוממו מראש של: 1) PIA, 2) PIA בתוספת 10% סוכרוז (ללא גליצרול), ו-3) PIA בתוסף של 300 מק"ג/מ"ל קרבניצילין.
3. דגרו צלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
4. מוציאים צלחות מהחממה ובודקים אותן לצמיחה. רקומביננטים אמיתיים של הצלבה כפולה יהיו רגישים לקרבניצילין ועמידים לסוכרוז (כלומר, מושבות שגדלו על PIA ו-PIA בתוספת סוכרוז, אבל לא גדלו על PIA בתוספת קרבניצילין).

חומרים