הכנה ובידוד של נבגי Streptomyces venezuelae מתרבית נוזלית

תקציר

מקור: Schlimpert, S., et al. הדמיית זמן-lapse פלואורסצנטית של מחזור החיים השלם של S. venezuelae באמצעות מכשיר מיקרופלואידי. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את הגידול והבידוד של נבגים מ-Streptomyces venezuelae. נבגים, תאים רדומים המסייעים לחיידקים לשרוד עקה, מיוצרים במהלך הגבלת חומרים מזינים ונאספים באמצעות צנטריפוגה. השיטה מבטיחה תרחיף נבגים טהור ומאוחסן בקור עבור יישומים במורד הזרם.

פרוטוקול

1. בידוד של נבגי סטרפטומיצס ונצואלה טריים והכנת מדיום תרבית משומש

1. יש לחסן 30 מ"ל תמצית שמרי מלטוז-תמצית מאלט (MYM), בתוספת תמיסת יסודות קורט R2 של 60 מיקרוליטר (TE), עם 10 נבגי מיקרוליטר של זן SV60 [attBφBT1::p SS209 (PdivIVA-divIVA-mcherry PftsZ-ftsZ-ypet)]. לצמיחה עקבית ונבגים של התאים, השתמש בבקבוק מבולבל או בבקבוק המכיל קפיץ כדי לאפשר אוורור מספיק.
2. תאי תרבית למשך 35-40 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-250 סל"ד.
3. בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה המותקן בנוזל. בשלב זה, שברי תפטיר ונבגים יהיו גלויים.
4. צנטריפוגה 1 מ"ל של תאים בצנטריפוגה שולחנית ב-400 x גרם למשך דקה אחת כדי לגלול את התפטיר ושברי תאים גדולים יותר.
5. העבירו כ-300 מיקרוליטר סופרנטנט המכיל תרחיף של נבגים לצינור חדש של 1.5 מ"ל והמשיכו על הקרח. שמור על התרבות הנותרת בינונית
6. מדללים נבגים 1:20 ב-MYM-TE (ריכוז סופי: 0.5-5 x 10⁷ נבגים/מ"ל) ושומרים על קרח עד הצורך.
   הערה: למרות שהתנאים המדויקים המעוררים נבגים בסטרפטומיצס אינם מובנים, שימוש במדיום MYM-TE משומש, כולל כל אותות חוץ-תאיים לא ידועים מתרבית נבגים, ממריץ נבגים.
7. יש לעקר 10 מ"ל ממדיום התרבית הנותר כדי לקבל MYM-TE משומש נקי מנבגים ושברי תפטיר. השתמש במסנן מזרק סטרילי של 0.22 מיקרומטר והעביר את MYM-TE משומש לצינור סטרילי של 15 מ"ל.
8. שמור את ה-MYM-TE המושקע המוכן למשך מספר ימים ב-4 מעלות צלזיוס אם יש לערוך ניסויים נוספים בתנאי גידול דומים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמצית מלטוזה-שמרי אקסטרקט-מאלט (MYM)4 גרם מלטוז4 גרם תמצית שמרים10 גרם תמצית לתתלהוסיף 1 ליטר H2O תוך שימוש ב-50% מי ברז ו-50% מי אוסמוזה הפוכה ותוסף עם 200 מ"ל תמיסת יסודות קורט R2 ל-100 מ"ל לאחר חיטוי			מדיום נבגים המשמש לתרבית Streptomyces venezuelae SV60
תמיסת יסודות קורט R2 (TE)8 מ"ג ZnCl240 מ"ג FeCl3-6H 2O2 מ"ג CuCl2-2H 2O2 מ"ג MnCl2-4H 2O2 מ"ג Na2B4O7-10H 2O2 מ"ג (NH4)6Mo7O24-4H 2Oadd 200 מ"ל H2OAutoclave ויש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס			הוסף 0.002 אמצעי אחסון ל- MYM
PBS (מי מלח חוצץ פוספט)	סיגמא	P4417-100TAB	משמש למילוי בארות כניסה של נתיבים שאינם בשימוש בלוחות B04A על מנת להכין צלחת לאחסון לטווח קצר.
מסנני מזרק 0.22 מיקרומטר	Satorius stedim	16532-ק	הכנת MYM-TE משומש