הדמיית זמן-lapse פלואורסצנטית של מחזור החיים של Streptomyces venezuelae

תקציר

מקור: Schlimpert, S. et al. הדמיית זמן-lapse פלואורסצנטית של מחזור החיים השלם של S. venezuelae באמצעות מכשיר מיקרופלואידי. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים הדמיית זמן-lapse פלואורסצנטית של מחזור החיים המלא של החיידק Streptomyces venezuelae באמצעות מכשיר מיקרופלואידי כדי להמחיש נביטה, צמיחת קורים ונבגים בזמן אמת.

פרוטוקול

1. הגדרת המיקרוסקופ ופרוטוקול זמן-lapse

הערה: שיטה זו יושמה על מיקרוסקופ שדה רחב הפוך ממונע ואוטומטי לחלוטין המצויד במצלמת sCMOS, מנורת מתכת-הליד, פוקוס אוטומטי חומרה, מחזיק במה ללוחות 96 בארות ותא סביבתי.

1. יש לחמם מראש את התא הסביבתי ל-30 מעלות צלזיוס מראש על מנת למנוע בעיות במיקוד האוטומטי לאחר תחילת הניסוי. הזמן הנדרש תלוי בתא הסביבתי בו נעשה שימוש, במיקרוסקופ ובמערכת החימום. התחילו לחמם את המערכת בלילה שלפני הניסוי.
2. הפעל את המיקרוסקופ ואת תוכנת האוטומציה והבקרה של המיקרוסקופ. השתמש ביעד טבילת שמן עם צמצם מספרי גבוה (NA) לאיסוף אותות אופטימלי ורזולוציה מרחבית, כגון יעד DIC שמן 100X, 1.46 NA. בחר מסננים מתאימים ומראות דיכרומטיות כדי לרכוש תמונות ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות (DIC) ותמונות של היתוך חלבון צהוב-פלואורסצנטי ואדום-פלואורסצנטי.
3. הנח טיפה של שמן טבילה על המטרה והוסף נוזל טבילה לתחתית חלון ההדמיה על הצלחת המיקרופלואידית כדי לשפר את מיקוד התא במהלך רכישת התמונה. התקן בזהירות את המכשיר המיקרופלואידי האטום על הבמה של המיקרוסקופ ההפוך. ודא שהצלחת ממוקמת היטב במחזיק הבמה ואינה זזה במהלך הניסוי.
4. הבא את חלון ההדמיה של תא התרבית המיקרופלואידית למיקוד באמצעות סמני המיקום המוטבעים להתמצאות. התמקדו בחלק השמאלי ביותר של תא הזרימה הראשון (המסומן "A") עם גודל המלכודת 5, המתאים לגובה השמנה של 0.7 מיקרומטר.
5. בתוכנת המיקרופלואידיקה, תאי עומס מבאר הכניסה 8 ב-4 psi למשך 15 שניות. בדוק את צפיפות התאים בתא התרבית על ידי הזזת השלב על פני חלון ההדמיה. אם לא נלכדו נבגים, חזור על שלב טעינת התאים או לחילופין הגדל את לחץ הטעינה ו/או הזמן עד להשגת צפיפות התא הרצויה (1-10 נבגים לחלון הדמיה עם 2,048 x 2,048 פיקסלים). הימנע מעומס יתר על תא התרבות. הערה: בדרך כלל אנו משתמשים במלכודת בגודל 5 להדמיית Streptomyces, אולם השגנו תוצאות טובות גם עם מלכודות בגודל 4 ו-3.
6. הפעל את תוכנית הזרימה בתוכנת הבקרה ואפשר לצלחת המיקרופלואידית להתייצב בחום למשך שעה אחת בשלב המיקרוסקופ לפני תחילת רכישת התמונה.
7. בתוכנת בקרת המיקרוסקופ, הגדר רכישה רב מימדית לצילום תמונות מרובות במיקומי שלבים מרובים לאורך זמן:
   1. עבור שמירה אוטומטית: ציין ספרייה לשמירה אוטומטית של קובצי התמונה.
   2. עבור הגדרות תאורה, קבע מראש הגדרות תאורה אופטימליות עבור כל מבנה ספציפי. עבור הניסוי המתואר, השתמש בזמני החשיפה הבאים: DIC 150 msec, YFP 250 msec, RFP 100 msec.
   3. עבור סדרות זמן: הגדר סדרת זמן כדי להשיג תמונות בנקודות הזמן הרצויות ברצף. להדמיית מחזור החיים של S. venezuelae, בחר מרווח זמן של 40 דקות על פני תקופה של 24 שעות.
   4. עבור עמדות במה ומיקוד אוטומטי: סרוק את תא התרבות על ידי הזזת הבמה ואחסן את מיקומי הבמה עבור כל עמדת הדמיה מעניינת. ודא שהמיקומים החד-שלביים ממוקמים מספיק זה מזה כדי למזער פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיות. בדרך כלל, השתמש בעד 12 מיקומים. הפעל שגרת פוקוס אוטומטי עבור כל נקודת זמן כדי לתקן סחיפה איטית של המוקד. אם זמין בתוכנת בקרת המיקרוסקופ, הגדר את אסטרטגיית המיקוד האוטומטי ל"עדכון משטח מקומי על ידי פוקוס אוטומטי של חומרה". לאחר אימות קואורדינטות ה-Z של עמדות הבמה שנבחרו, הפעל את המיקוד האוטומטי של החומרה.
8. התחל את ניסוי ה-time-lapse בתוכנת בקרת המיקרוסקופ.
9. בדוק שכל מיקומי הסטייג' עדיין ממוקדים בנקודות מאוחרות יותר. עבור ניסויי זמן-lapse הנמשכים על פני מספר שעות, אנו צופים מדי פעם בסחיפה של שלב גם בעת שימוש בפוקוס אוטומטי. אם יש צורך למקד מחדש את מיקומי השלב, עצור את הניסוי בנקודת זמן מתאימה, כוונן את המיקוד והפעל מחדש את הניסוי במרווח זמן ההדמיה שהוגדר.
10. הפסק את רכישת התמונה לאחר 24-30 שעות או כאשר הקורים באזור העניין התמיינו לנבגים. לאחר מכן, עצור את תוכנית הזרימה בתוכנה ופרק את המכשיר המיקרופלואידי.
11. הכן צלחת מיקרופלואידית משומשת לאחסון לטווח קצר. הסר את המדיה שנותרה מבאר 1 עד 6, רוקן את באר הפסולת 7 והעמסת תאים באר 8. בתנאים סטריליים, יש למלא מחדש בארות משומשות של נתיב "A" ובארות של נתיבים שאינם בשימוש ("B" עד "D") על הצלחת בתמיסת מלח סטרילית עם חוצץ פוספט (PBS). אטמו את הצלחת עם פרפילם כדי למנוע את התייבשותה ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת B04A CellAsic ONIX לתאי חיידקים	מרק-מיליפור	B04A-03-5PK	לוחות תרבית מיקרופלואידיים
מערכת זלוף מיקרופלואידית CellAsic ONIX ו-ONIX FG (גרסה 5.0.2)	מרק-מיליפור	EV-262	את הגרסה העדכנית ביותר של ONIX (יולי 2015) והוראות לשימוש בתוכנה ניתן למצוא כאן: http://www.merckmillipore.com
מיקרוסקופ Axio Observer.Z1	צייס	431007-9902-000	מיקרוסקופ שדה רחב הפוך אוטומטי וממונע לחלוטין
אינקובטור XL multi S1 עם מודול טמפרטורה S1 ויחידת חימום XL S2	צייס	411857-9061-000	תא סביבתי המקיף את המיקרוסקופ
Plan-Apochromat 100x/1.46 מטרת שמן DIC	צייס	420792-9800-000
אוקרה פלאש 4 V2	Hamamatsu Photonics K.K.	C11440-22CU
תאורה HXP 120V	צייס	423013-9010-000
סט מסנני FL 46 HE YFP ללא משמרת	צייס	489046-9901-000	סט מסנני פלורסנט, עירור 500/25 ננומטר, פליטה 535/30 ננומטר
סט מסנני FL 63 HE RFP ללא משמרת	צייס	489063-0000-000	סט מסנני פלורסנט, עירור 572/25 ננומטר, פליטה 629/30 ננומטר
מסגרת הרכבה K-M ללוחות מרובי בארות	צייס	000000-1272-644	מחזיק במה לצלחת מיקרופלואידית
זן פרו 2012	צייס	410135-1002-120	תוכנת בקרת מיקרוסקופ
זמן-lapse של מודול ZEN	צייס	410136-1031-110	מודול תוכנה להגדרת ניסויי מיקרוסקופיה בהילוך מהיר
אריחים/מיקומים של מודול ZEN	צייס	410136-1025-110	מודול תוכנה לשמירת מיקומי במה ספציפיים (xzy)
פיג׳י	חבילת תוכנה בקוד פתוח	http://fiji.sc/Fiji	יצירת סרטוני דולג זמן
PBS (מי מלח חוצץ פוספט)	סיגמא	P4417-100TAB	משמש למילוי בארות כניסה של נתיבים שאינם בשימוש בלוחות B04A על מנת להכין צלחת לאחסון לטווח קצר.
SV60	אוסף הזנים של מרכז ג'ון אינס		זן S. venezuelae המבטא divIVA-mcherry ו-ftsZ-ypet